Шпаргалка по "Фтизиатрии"

Метод окраски по Цилю-Нильсену наиболее часто используется при бакгериоскопичсском выявлении микобактерий. Он заключается в следующем: мазки мокроты окрашивают фуксином при нагревании, затем обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают метиленовым синим. В результате микобактерий окрашиваются в малиновый цвет, а фон — в синий. Это специфическое окрашивание обусловлено способностью микобактерий удерживать краситель при обработке кислотой или спиртом.

В бактериологических лабораториях, выполняющих большое количество исследований (100 и более ежедневно), используется люминесцентная микроскопия. Данный метод основан на способности липидов микобактрий воспринимать люминесцентные красители (акридиновый оранжевый, аурамин, родамин и др.) и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от красителей, микобактерий туберкулеза дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое - на темно-зеленом фоне. Метод люминесцентной микроскопии обладает большей чувствительностью, чем световая микроскопия, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала (микроскопия осадка), поскольку люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить измененные микобактерий, утратившие кислотоуетойчивость. в связи с чем они не выявляются при бактериоскопии по Цилю-Нильсену. Мазки для люминесцентной микроскопии готовят из осадка, полученного после обработки диагностического материапа детергентом с последующим отмыванием либо нейтрализацией. При положительном результате бактериоскопии мазков, окрашенных флуорохромами, должна быт ь проведена подтверждающая микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену

Бактериоскопическое исследование необходимо проводить очень тщательно. Обычно образец исследуют в течение 15 минут (что соответствует просмотру 300 полей зрения), чтобы сделать заключение об отсутствии или наличии КУБ в препарате. При окрашивании флюорохромами для исследования одного мазка требуется меньше времени.

Основным диагностическим материалом для бактериоскопии на КУБ служит мокрота. Результаты бактериоскопического исследования на КУБ других биологических материалов (различных жидкостей, тканей, гноя, мочи и т.д.) имеют ограниченное значение для диагностики туберкулеза. Так. исследование

мазков из осадка центрифугированной мочи не всегда позволяет получить достоверные результаты, поскольку в моче могут присутствовать нетуберкулезные микобактерий. Поэтому выявление КУБ в моче не всегда свидетельствует о наличии специфического процесса. В мазках из осадка промывных вод желудка и других материалов могут обнаруживаться кислотоустойчивые са-профиты, которые легко спутать с МВТ.

Результат микроскопического исследования позволяет сделать заключение только о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых бактерий. Достоверно диагноз «туберкулез» можно установить только после выделения из клинического материала культуры МБТ с помощью культурального метода и ее идентификации. Отрицательный результат бактериоскоскопического исследования не исключает диагноз «туберкулез», так как в мокроте некоторых пациентов может содержаться меньше микобактерий, чем позволяет выявить бактериоскопия.

Количество обнаруженных КУБ определяет степень тяжести заболевания и опасности больного для окружающих. Следовательно, исследование должно быть не только качественным, но и количественным. В современных эпидемиологических и экономических условиях бактериоскопическое исследование мокроты у обратившихся в ЛПУ за врачебной помощью лиц с клиническими симптомами, подозрительными на туберкулез, является приоритетным направлением в тактике раннего выявления данного заболевания. Возрастание роли этого метода связано также с возникновением в последние годы остропрогрессирующих форм заболевания, сопровождающихся выраженными клиническими проявлениями и обильным

Культуральное (бактериологическое) исследование. Начиная со времени проведения работ Коха и до 1924 г. усилия ученых, направленные на поиски методов выделения чистых культур микобактерий туберкулеза, не имели особых успехов. В 1924 г. Левенштейн и Сумиоши установили, что кислоты и щелочи в известных концентрациях и при определенных экспозициях убивают сопутствующую микрофлору, не влияя на жизнеспособность МБТ. Этот метод при непрерывном совершенствовании стал приобретать практическое значение. В настоящее время бактериологическое (культуральное) исследование биологического материала на МБТ благодаря его высокой чувствительности (от 10 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл исследуемого материала) и специфичности в сочетании с микроскопическим методом является «золотым стандартом» в диагностике туберкулеза. Бактериологическое исследование на туберкулез выполняется в специализированных бактериологических лабораториях противотуберкулезных диспансеров или посевных пунктах.

Материал для бактериологического исследования собирают асептически. Перед проведением бактериологического исследования поступившие в лабораторию пробы обрабатывают растворами кислот или щелочей с последующим центрифугированием. Это необходимо дня разжижения и концентрации образца, а также для предотвращения контаминации, поскольку пробы мокроты вязкие по консистенции и содержат большое количество микрофлоры. Около 1 мл разжиженного и деконтаминированного клинического образца засевают в пробирки со средой и инкубируют при 37°С в течение 10 недель.

Для культивирования микобактерий используют плотные (яичные, агаровые) и жидкие питательные среды. Яичные среды содержа! цельные яйца или яичный желток, а также фосфолипидьг, белки и другие ингредиенты. С целью предотвращения контаминации к среде добавляют некоторые красители, например, малахитовый зеленый, а также антибиотики. Поэтому яичные среды (Левеншейна-Йенсена, Финна), на которых культивируют микобактерий. имеют сине-зеленый цвет. Использование яичных сред позволяет получить видимый рост колоний М tuberculosis через 18-24 дня в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. Однако качество ингредиентов, из которых готовится среда, иногда значительно варьирует, что может влиять на воспроизводимость результатов. По сравнению с яичными агаровые среды имеют ряд преимуществ: они готовятся из полусинтетических основ, что обеспечивает более стабильное качество и воспроизводимость результатов. Детекция роста МБТ на агаровых средах возможна через 10-14 дней. Однако агаровые среды дороже, требуют присутствия СО2 в атмосфере и инкубируются в термостате не более 1 месяца.. Как правило для выделения микобактерий используется набор из двух разных питательных сред.

Автоматические системы. Разработка радиометрической системы ВАСТЕС 460 (Becton Dickinson) ознаменована собой качественный прорыв в быстрой детекции микобактерий и определении их лекарственной чувствительности

Автоматические системы, предназначенные для выявления микобактерий туберкулеза, позволяют проводить детекцию роста микобактерий в 2-3 раза быстрее, чем классические методы. Положительный результат анализа должен обязательно подтверждаться бактериоскопически. В практике бактериологических лабораторий исследование с использованием автоматических систем обязательно проводится параллельно с исследованием на плотных питательных средах

Идентификации микобактерий. Несмотря на то, что морфология колоний, наличие пигмента и ростовые характеристики дают некоторое

представление о выделенном штамме микобактерий, для установления их видовой принадлежности микобактерий используют комплекс специальных лабораторных тестов. В 1970-х гг. Международной рабочей группой по таксономии микобактерий была стандартизована серия высоко воспроизводимых биохимических гестов, которые не требуют сложного технического обеспечения и могут быть проведены за несколько часов или дней. Это способность штамма микобактерий синтезировать никотиновую кислоту, восстанавливать нитраты, продуцировать уреазу, проявлять различную резистентность к антибиотикам, а также каталазная активность и термостабильность каталазы штамма МБТ. Кроме этого, для идентификации микобактерий используется набор бактериологических тестов: скорость роста на питательных средах, способность микобактерий образовывать корд-фактор, пигмент, расти на яичной или простой агаровой среде при разных температурных режимах; на средах, содержащих NaCl, пара-нитробензойную кислоту или салициловокислый натрий.

Методы определения лекарственной чувствительности микобактерий.

В лабораторной практике используют три основных метода определения лекарственной чувствительности микобактерий: метод абсолютных концентраций; метод соотношения резистентности; метод пропорций.

Метод абсолютных (предельных) концентрации заключается в следующем. Микобактерий выращивают на питательных средах, содержащих противотуберкулезные препараты (ПТП) в различных концентрациях. Определение лекарственной чувствительности МБТ может быть прямым (посев на среды с противотуберкулезными препаратами патологического материала) и непрямым (посев на среды с противотуберкулезными препаратами выделенных культур микобактерий). Прямой способ позволяет значительно ускорить процесс получения результата, но им можно пользоваться только тогда, когда микобактерий обнаруживаются в исследуемом материале бакгериоскопически и содержатся в нем в значительном количестве. Лекарственную чувствительность можно определять на плотных и жидких питательных средах. В современной лабораторной практике ее обычно определяют на среде Левенштейна- Йенсена. не содержащей крахмала, которая принята ВОЗ в качестве международного стандарта. Унификация определения лекарственной чувствительности МБТ позволяет получать сравнимые результаты при проведении эпидемиологических исследований. При определении лекарственной чувствительности на плотных питательных средах результат учитывают через 3 недели после посева по макроросту МБ'Г на поверхности среды, на жидких питательных средах — через 10-12 дней по наличию микроколоний в виде переплетающихся жгутов и кос в мазках из осадка.

Определение лекарственной чувствительности на плотных и жидких питательных средах имеет свои преимущества и недостатки. На плотных средах можно получить более четко сравнимые результаты. При массовых исследованиях этот метод менее трудоемок, однако он более продолжителен по времени получения результата. В плотных средах во время свертывания может несколько уменьшаться содержание некоторых термолабильных препаратов, например, стрептомицина. Определение лекарственной чувствительности на жидких средах более трудоемко, требует микроскопии препаратов, но результат может быть получен в более короткие сроки. Недостатком этого способа является то, что больные, леченные антибактериальными препаратами, могут выделять микобактерий, лишенные корд-фактора, не дающие при размножении жгутов или наукообразных микроколоний, наличие которых служит критерием устойчивости к препарату.

Метод соотношения резистентности (resistance ratio method) заключается в определении соотношения минимальных ипгибирующих концентраций противотуберкулезных препаратов для тестируемого штамма и референс-штамма H37RV. чувствительного ко всем препаратам. Величина соотношения 2 и менее характеризует шгамм как чувствительный. 8 и более — как устойчивый.

Вариантом метода минимальных ипгибирующих концентраций является E-tcst. Лекарственная устойчивость микобактерий с использованием этого метода определяется на чашках с агаровой средой, на которые помещают полоски, содержащие градиент концентраций противотуберкулезных препаратов. Чувствительность микобактерий к препаратам оценивается по наличию зоны ингибирования роста микобактерий вокруг полоски. Использование E-tesl позволяет определять лекарственную чувствительность МБ'Г в течение 5-10 дней.

Метод пропорции был предложен Canetti в 1963 году. Он заключается в определении соотношения числа колоний, выросших на среде, содержащей противотуберкулезный препарат, и числа колоний в контрольной пробирке, не содержащей препарата. Это соотношение является отражением пропорции резистентных бактерий в популяции. Метод позволяет количественно оценить степень резистентности штамма МБТ, однако широкое применение его в классическом варианте затруднено вследствие большой трудоемкости. Определение лекарственной чувствительности микобактерий методом пропорций может проводиться с использованием автоматических систем ВАСТЕС, МО IT, Esp Culture System и др

Целью интерпретации результатов определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП являются прогнозирование клинической эффективности ПТП у конкретного больного и обоснование рекомендаций по

ОУи. д

проведению оптимальной химиотерапии.

В качестве критериев для отнесения штаммов МБТ к категории чувствительных или устойчивых используют пороговые значения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) ПТП, избранные на основе комплекса микробиологических, фармакокинетических и клинических показателей. Данные о величине МИК Г1ТГ1 в отношении штаммов МБТ, выделенных от больных, служат микробиологическим критерием для определения величины пороговых концентраций. Кроме того, при определении пороговых МИК учитывают данные по фармакокинетике ПТП. Основным показателем при этом является максимальная концентрация Г1ТП, которая создается в сыворотке крови после приема ПТП в среднетераггевтической дозе. Четкая зависимость между этим показателем и величинами пороговых МИК отсутствует. В самом общем веде можно лишь сказать, что пороговые МИК не могут быть выше максимально достижимых в сыворотке крови. И, наконец, третьим критерием для определения пороговых значений МИК служат данные о клинической эффективности ПТГ1 при заболевании, вызываемом микроорганизмами с различными МИК. Таким образом, предложенные в разных странах пороговые значения МИК ПТП являются плодом консенсуса между ведущими экспертами, а не результатом точных расчетов. По мере накопления опыта их периодически пересматривают. Несмотря на определенную условность рекомендованных пороговых значений МИК ПТП, они являются единственной основой для первого этапа интерпретации результатов оценки чувствительности МБТ к Г1ТП.