Шпаргалка по "Фтизиатрии"

Биологические методы диагностики туберкулеза

Биологическая проба (биопроба).

Биопроба является еще одним методом выявления микобактерий. Для этого чувствительных к туберкулезу животных (чаще всего морских свинок) заражают патологическим материалом, взятым от больного, и в течение 3 месяцев наблюдают за их весом, поведением, местными изменениями. Если в течение этого срока животное не погибнет, его забивают. Морских свинок, забитых или погибших, обязательно вскрывают и оценивают туберкулезные изменения, произошедшие в их органах животных при развитии специфического процесса. Даже при отсутствии специфических изменений для подтверждения диагноза из лимфатических узлов, легких, печени, селезенки готовят мазки, которые окрашивают по Цилю-Нильсену. Кроме того, кусочки указанных органов гомогенизируют и высевают на питательные среды. В сомнительных случаях выполняют гистологическое исследование тканей. Чувствительность биологического метода выявления микобактерий высока (несколько клеток МБТ на пробу). Однако в последнее время появились сообщения о том, что результат биологического исследования не всегда коррелирует с данными клинико- рентгенологического обследования.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Полимеразная цепная реакция.

Получение более совершенных питательных сред, разработка автоматических систем позволяют сокращать сроки выявления и идентификации микобактерий. Однако они все еще остаются достаточно длительными и зависят от количества возбудителя в инфекционном материале. Современные молекулярно- генетические методы открывают в этой области значительные перспективы, так как позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью проводить выявление и типирование микобактерий в различном диагностическом материале.

Наиболее часто на практике используется молекулярно-генетический метод, в основе которого лежит принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР).

ПЦР — принципиально очень простой метод амплификации, т. е. умножения нуклеиновых кислот. Он был открыт в середине 1980-х гг. Кагу Mullis с соавторами (биотехнологическая компания «Cetus», США).

Метод ПЦР основан на повторении трех этапов, проходящих при разных температурных режимах. На первом эгапе двухцепочечную ДНК денатурируют путем кратковременного нагрева инкубационной системы до 90-95^сС. Таким образом, две цепочки ДНК остаются в растворе в не связанном друг с другом состоянии до тех пор. пока температура не будет понижена. На следующем этапе, получившем название этапа отжига праймеров, который проходит при 40-60°С, с участками одноцепочечных молекул ДНК, фланкирующими последовательность-мишень, связываются праймеры. Это короткие участки РНК длиной около 20 нуклеотидов. Каждая из затравок связывается только с одной цепочкой ДНК. Следующий шаг ПЦР умножение последовательности-мишени с помощью полимеразы. Поскольку инкубационная система на этапе денатурации ншреваегся до 90-95°С, в ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза, выделенная из Thermus aquaticus. Этап достройки затравок проходит при 70-75°С. На этом заканчивается первый цикл амплификации. Далее все этапы повторяются 20-25 раз. В результате количество ДНК-мишени возрастает в геометрической профессии.

На практике из патологического материала, взятого от больных, при помощи специальных методов выделяют ДНК. К ней добавляют реакционный буфер, смесь нуклеозидтрифосфатов, праймеры, полимеразу и проводят амплификацию в программируемом термостате (термоциклере). Результат учитывают с помощью электрофореза в агарозиом геле или с помощью иммобилизованных фрагментов ДНК. Присутствие в пробе последовательности-мишени свидетельствует о наличии МБТ в исследуемом образце. ПЦР позволяет выявлять 1-10 бактериальных клеток в 1 мл биологического материала. Специфичность реакции — 97-98%.

Исследованию методом ПЦР подлежат мокрота, бронхиальный секрет, плевральная и другие жидкости, моча, периферическая и менструальная кровь, соскобы эпителиальных клеток цервикального канала.

Следуег отметит ь, что с помощью ПЦР нельзя определить активность туберкулезного процесса, поэтому интерпретировать полученный результат необходимо с учетом клинико-рентгенологических данных. Метод ПЦР можно использовать как дополнительный диагностический метод при дифференциальной диагностике в комплексе с другими методами лабораторной диагностики туберкулеза и нельзя использовать в качестве скринингового метода для выявления больных туберкулезом из-за возможности ложноположительных резуль- iuiob. Кроме ю10. препятствием для широкого использования данного метода служит необходимость использования дорогостоящего оборудования и диагностических наборов.

ПЦР — не единственный амплификационный метод детекции микобактерий. Применение амплификационных методик для выявления различий в генетической структуре чувствительных и устойчивых штаммов —• еще один новый подход к определению лекарственной чувствительности микобактерий. Проводит ь данные исследования стало возможным благодаря определению нуклеотидных последовательностей генов, мутации в которых при водят к возникновению резистентности к противотуберкулезным препарат ам. При использовании амплификационных методов значительно сокращаются сроки исследования. Главным ограничением для их применения служит существование других механизмов резистентности. С помощью амплификационных методик не обнаруживается около 10% случаев устойчивости к рифампицину, 20% — к изониазиду и 40% — к стрептомицину. Поэтому молекулярные методы, никогда не смогут полностью заменить классические культуральные методы определения лекарственной устойчивости МБТ.

Генотипирование.

Исследования по эпидемиологии туберкулеза в течение длительного времени тормозились отсутствием точного и воспроизводимого метода субтитрования клинических изолятов для изучения распространения штаммов МБ'Г. Совершенствование молекулярно-генетических методов позволило разработать высокоспецифичные маркеры для типирования штаммов МБТ.

Штаммы МБГ невозможно различить с помощью рутинных биохимических тестов или серологических методов. Устойчивость к ПТП в некоторых случаях является воспроизводимым маркером, но этот маркер не является общепринятым. До недавнего времени единственным пригодным методом для типирования штаммов МВТ служил метод фаг оптирования. Однако он технически сложен и использовался в немногих лабораториях, поскольку не позволяет добиться необходимой специфичности, и с его помощью можно выделить лишь ограниченное число фаготипов.

Генотипирование позволяет использовать в качестве маркеров тонкие различия в хромосоме микобактерий, не вызывающие фенотип и ческих различий. Поскольку получаемая в результате исследования картина индивидуачьна для конкретного штамма (как отпечатки патьцев для человека), данный метод получил название геномной дактилоскопии (DNA fingerprint).

Для типирования чаще всего используют специфичную для М tuberculosis повторяющуюся мобильную последовательность ДНК, которая демонстрирует необходимый уровень полиморфизма. Число копий этой последовательности высоко у большинства изолятов М. tuberculosis (7-20), низко у большинства изолятов М. bovis от животных (1-4) и у различных штаммов А/, hovis BCG (1-2).

Метод генотипирования основан на использовании рсстрикционных эндонуклеаз. которые распознают специфические последовательности и нарезают ДНК на фрагменты разной длины. Содержание гуанина и цитозина в микобактериальной ДНК высоко (около 65%), поэтому целесообразным признано использование энзимов, распознающих фрагменты, богатые аденином и тимином, и разрезающих Д11К на небольшое число крупных фрагментов.

Стандартный метод предусматривает следующие этапы: выделение микобактериальной ДНК. ее рестрикцию с использованием эндонуклеаз, разделение рестрикционных фрагментов путем электрофореза и детекцию последовательности-мишени посредством гибридизации с меченой ДНК. Полученная в результате совокупность электрофорегических полос (фингерпринт) отражает число копий данной последовательности ДНК (каждая полоса соответствует одной копии последовательности-мишени), а также гетерогенность в длине рестрикционных фрагментов, которая обычно является результатом точковых мутаций, создающих или уничтожающих сайты рестрикции, либо делеций или других хромосомных перестроек, что нашло отражение в термине «полиморфизм длины рестрикционных фрагментов» {Restriction Fragment Length Polymorphism. RFLP).

Использование метода в стандартном варианте осложняется необходимостью экстракции почти 1 мкг

OHi. «3

ДНК из каждою изолята. Поэтому в настоящее время разработаны два варианта метода геномной дактилоскопии, основанные на использовании ПЦР. Они позволяют использовать очень маленькое количество ДНК и получать картину, сопоставимую по специфичности со стандартным методом. В таких вариантах исследование может быть выполнено на бактериях из нескольких колоний или старых нежизнеспособных культурах, а также клинических бактериоскопически положительных образцах.

Выделенные при вспышке заболевания изоляты МБТ с большой долей вероятности демонстрируют одинаковую генотипическую картину. Поэтому изоляты, связанные с конкретной вспышкой заболевания, можно легко идентифицировать. Однако пока не проведено масштабное исследование с целью определения предполагаемого числа возможных геногипических вариантов в конкретном географическом регионе.

Первым применением генотипирования изолятов МБТ было отслеживание вспышек туберкулеза. Так, с использованием этого метода была установлена причина вспышки туберкулеза, вызванной инъекциями контаминированных лекарственных препаратов. Эта работа продемонстрировала полезность геномной дактилоскопии для проведения эпидемиологических исследований и показала, что с использованием данного метода можно идентифицировать изоляты, связанные со вспышкой, среди большого количества изолятов. Доказана полезность геномной дактилоскопии в отслеживании распространения полирезистентных штаммов. В результате нескольких исследований было описано нозокомиальное распространение таких штаммов среди ВИЧ-инфицированных больных. В каждом из таких исследований были идентифицированы 1 или 2 штамма, связанные со вспышкой заболевания. Используемая для типирования последовательность ДНК не кодирует лекарственную чувствительность, поэтому резистентность к ПТП не влияет на картину фингерпринта. Однако в данном случае фингерпринт может служить маркером данного штамма и указывать на лекарственную резистентность новых изолятов с таким же фингерпринтом.

При эпидемиологических исследованиях вспышек полирезистентного туберкулеза лекарственная устойчивость указывает на возможность эпидемиологической связи между штаммами, геномная дактилоскопия обеспечивает окончательное доказательство. Метод даже более полезен для проведения исследования полирезистентных изолятов, поскольку это единственный метод доказательства родства штаммов. Широкомасштабное применение этого метода ко всем изолятам в данной географической зоне может выявить циркулирующие штаммы МБТ и идентифицировать ранее неизвестные источники распространения туберкулезной инфекции. Однако в настоящее время еще не установлено, является ли такое применение метода практически осуществимым, поскольку лабораторное изучение изолятов МБТ легче, чем исследования, необходимые для отслеживания распространения штаммов с использованием геномной дактилоскопии. Метод можно также использовать для подтверждения кросс-контаминации культур и других ошибок, допускаемых при лабораторном исследовании.

21. Туберкулин. Виды туберкулина. Международный и национальный стандарты туберкулина Туберкулиновая единица. Сенситины.

Туберкулин был получен Кохом в Берлине в 1890 г. Он представлял собой специально обработанную водно-глицериновую вытяжку из культуры MKT и позже был назван старым, или альттуоеркулином. Старый туберкулин Коха включал много балластных веществ из питательной среды, на которой культивировались микобактерии. С наличием этих веществ, в основном белков, связывают нередкое возникновение разных неспецифических реакций при введении старого туберкулина.

В 1934 г. Ф. Зайберт и С. Гленн в Филадельфии создали более чистыи препарат — Purified protein derivative (PPD-S). В нашей России сухой очищенныи туберкулин был изготовлен в 1939 г. в Ленинградском НИИ вакцин и сывороток под руководством М. А. Линниковой и получил название ППД-Л.

По биохимическому составу туберкулин является сложным соединением из: -туберкулопротеинов, -полисахаридов, -липидных фракций, -нуклеиновых кислот.

Он содержит остатки микробных тел и продукты жизнедеятельности возбудителя туберкулеза.

С иммунологических позиций туберкулин является специфическим аллергеном и неполным антигеном, содержащим отдельные антигенные компоненты МБТ.

Препарат дозируется в условных туберкулиновых единицах — ТЕ. В соответствии с международным стандартом за 1 ТЕ принимают такое количество туберкулина, на которое положительно реагируют 80—90 % инфицированных людей. В 1 ТЕ 0,00006 мг сухого препарата ППД-Л или 0,00002 мг PPD-S.

В России выпускают 2 вида туберкулина ППД-Л:

• очищенный туберкулин в стандартном разведении — одна ампула с 2 мл раствора, в 0,1 мл которого содержится 2ТЕ ППД-Л;

• сухой очищенный туберкулин в ампулах по 50 000 ТЕ, который подлежит разведению в прилагаемом карболи-зированном изотоническом растворе натрия хлорида.

Очищенный туберкулин в стандартном разведении с 2ТЕ Г1ПД-Л в 0,1 мл раствора применяют для массовой и индивидуальной туберкулинодиагностики при пробе Манту.

Сухой очищенный туберкулин используют только в специализированных противотуберкулезных учреждениях для различных туберкулиновых проб.

22.Методика, техника постановки и оценка пробы Манту с 2ТЕ. Показания и противопоказания для ее постановки

Наиболее распространена внутрикожная проба Манту.

Методика.Не делают по назначению врача специально обученная медицинская сестра или фельдшер, имеющие документ — допуск к проведению туберкулинодиагностики. Пробу Манту чаще проводят в амбулаторных условиях.

Техника постановки. Для пробы Манту применяют специальные туберкулиновые шприцы разового пользования емкостью 1 мл и тонкие короткие иглы с крутым косым срезом. В шприц набирают 0,2 мл раствора туберкулина и выпускают из него 0,1 мл с тем, чтобы объем вводимого препарата составил 0,1 мл (2ТЕ). На внутренней поверхности средней трети предплечья участок кожи обрабатывают 70° этанолом и просушивают. Иглу вводят срезом вверх в поверхностный слой натянутой кожи (внутри-кожно) параллельно ее поверхности. После погружения отверстия иглы в кожу из шприца вводят иЛ мл раствора туоеркулина. При правильной технике в коже образуется папула в виде белесоватой лимонной корочки диаметром не менее 7— 9 мм