Шпаргалка по "Вирусологии"

Диплоидные  культуры клеток. Это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная  в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся в процессе пассирования кариотипом, свойственным исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморагенной активностью при трансплантации хомячкам. Диплоидные культуры клеток, так же как и перевиваемые, получают из первичных культур клеток. Кариотип клеток очень лабилен и при обычных методах культивирования клеток он изменяется в первые дни. Поэтому потребовались специальные методы обработки ткани, питательные среды высокого качества, фетальная сыворотка для длительного поддерживания клеток in vitro в диплоидном состоянии.

 Диплоидные  клетки получают из различных  тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце  и др.) и животных (почки эмбриона  крупного рогатого скота, свиней, почки хомяка). Диплоидные клетки  в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50 ± 10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, так как при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (-196°С) и при необходимости восстановить. Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемыми и первичными клетками: 10-12 дней они могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособными в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам. Суспензионные культуры клеток. В 1953г. Оуэне с сотрудниками показали способность клеток размножаться в свободносуспендированном состоянии. В последующие годы этот метод был значительно усовершенствован: была создана современная аппаратура, обеспечивающая размножение клеток со строго заданными параметрами (температура, рН, скорость перемешивания), а также адаптированы многие линии перевиваемых клеток к размножению в этих условиях. Выращивание вирусов в суспензионных культурах клеток открывает большие возможности в промышленном производстве вакцин и диагностикумов. Однако только перевиваемые клетки хорошо культивируются в суспензии. Новый подход к культивированию клеток в суспензии - применение микроносителей (сефадекс, силикагель, цитолар и др.). На микроносителях культивируемые клетки формируют монослой.

Таким образом, этот способ позволяет методами суспензионного культивирования выращивать зависимые  от прикрепления к твердому субстрату  клетки: первичные, субкультуры, диплоидные. Эти клетки принято называть поверхностно зависимыми. Способ культивирования  на микроносителях в настоящее время чрезвычайно популярен, так как он открывает большие перспективы в клеточной биотехнологии, в получении вакцин и других биологически активных веществ (интерферон, гормоны и т.д.). Хранение культур клеток. Каждый из трех основных типов клеточных культур - первичных культур, диплоидных штаммов и перевиваемых линий клеток, используемых в вирусологических исследованиях, часто приходится консервировать, так как при продолжительном пассировании клеток in vitro есть опасность бактериального загрязнения и неконтролируемых (генетических) изменений самих клеток.

Выделенные  изоляты, как и штаммы стандартных вирусов, необходимые для сравнения и серологических исследований, следует хранить в условиях, обеспечивающих им максимально длительную жизнеспособность. При рН среды 7,0-7,4 и внесении в нее определенных добавок вирус можно хранить при 4° в течение нескольких недель, а некоторые виды - в течение года без потери инфекционных свойств.

Многие  вещества обладают консервирующим или  защитным свойством по отношению  к вирусам. Чаще всего используют глицерин, который обладает бактериостатическим  действием, но в то же время и защищает вирусы. Его применяют в качестве добавок к вируссодержащему материалу  в количестве 10-40%. Довольно широко применяется  также фенол, который в концентрации 0,2-0,5% большинство вирусов не инактивирует (например, вирусы чумы свиней, болезни  Ауэски, ящура). Для консервирования вирусов можно использовать 5-20%-ный раствор NaCI, 10%-ный раствор глицерина, 0,15 M раствор KCI. Стабильность вирусов значительно увеличивается в результате добавления 1-10% глюкозы, сахарозы или мальтозы, 10-50% сыворотки или сывороточного альбумина, 10-50% обезжиренного молока, 0,1-2,0% желатина. Чем меньше белка в вируссодержащей взвеси, тем меньше его стабильность. Поэтому очищенные вирусы быстро теряют свою биологическую активность.

При хранении вирусов целесообразно также  использовать полимеры: 0,5-3%-ную метилцеллюлозу или 0,1-2%-ный поливиниловый спирт. Хорошим стабилизирующим действием на некоторые вирусы обладает 5%-ный ДМСО (диметилсульфоксид), проявляющий при этом и антибактериальные свойства. Вирусы в культуральной жидкости стабилизируются компонентами питательной среды (сыворотка, гидролизат и др.).

Таким образом, большинство вирусов можно сохранять при температуре 4^oС в течение нескольких недель и даже нескольких лет при условии добавления указанных выше компонентов-стабилизаторов. Однако известно, чем ниже температуры замораживания вируса, тем дольше сохраняется его жизнеспособность. При быстром замораживании небольших количества вируса до минус 190°С с последующим хранением при этой температуре практически не снижается титр вируса. Такая температура, однако, очень редко используется в диагностической работе. В лабораториях хорошие результаты дает сохранение вирусов при температуре минус 70°С.

Использование стабилизирующих веществ необходимо не только при хранении вируса, но и  для предотвращения потерь его в  процессе самого замораживания, особенно вируссодержащих образцов экстраэмбриональной и культуральной жидкости. Если же в культуральной питательной среде содержится 2-19% сыворотки или гидролизата лактальбумина, то ее можно заморозить без добавления стабилизирующих веществ. Хорошее защитное действие при замораживании вирусов и хранении их в таком состоянии оказывает добавление к вируссодержащему материалу одного из таких компонентов, как 10-30% сыворотки крови, инактивированной при 56-60°С; 0,5-1,5% желатина; 20-50% обезжиренного молока; 0,1-0,5%

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 59. Аденовирусная инфекция  крупного рогатого скота.

Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота (аденовирусная  пневмония телят, аденовирусный пневмоэнтерит телят) (adenoviridae infection) — остро протекающее заболевание молодняка сельскохозяйственных животных, характеризующееся поражением органов дыхания, пищеварения, лимфоидной ткани, конъюнктивитами. Крупный рогатый скот часто является носителем латентных аденовирусов, вызывающих бессимптомные инфекции.

Систематическое положение вируса. Возбудителем аденовирусной инфекции является ДНК-геномный вирус, принадлежащий к семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus. Вирусные частицы имеют форму икосаэдра, размер — от 73 до 87 нм, суперкапсида отсутствует. В настоящее время известно 32 типа аденовирусов человека, 25 типов — крупного рогатого скота, 4 типа — овец, по 2 типа аденовирусов собак и мышей, 8 типов кур.

Штаммы  аденовирусов крупного рогатого скота 1-го, 2-го и 3-го серотипов имеют общий  комплементсвязывающий антиген, отличающийся от антигена типов 4, 5, 6. На основании  этих свойств аденовирусы к.р.с. делят  на 2 антигенные подгруппы. Аденовирусы первой подгруппы более близки по биологическим свойствам к аденовирусам человека. Отдельные серотипы аденовирусов обладают онкогенными свойствами.

Аденовирусы в зависимости от серотипа вызывают гемагглютинацию эритроцитов белых  крыс (1-й и 2-й серотипы), белых  мышей (2-й серотип), обезьян.

Эпизоотологические данные. В естественных условиях аденовирусной инфекцией чаще заражаются телята в возрасте от 2-недель до 4-мес., а также поросята, ягнята, цыплята, жеребята, щенята собак, лисиц, песцов. Установлена повышенная чувствительность к аденовирусной инфекции у жеребят арабских пород.

Источником возбудителя инфекции являются больные животные, выделяющие вирус с носовыми истечениями и фекалиями. Заражение происходит аэрогенным и алиментарным путями, через конъюнктиву глаз, при непосредственном контакте. Факторами передачи служат загрязненные выделениями больных животных, корм, вода, воздух, подстилка, инвентарь и др.

Клиническая картина. У взрослых животных аденовирусная инфекция протекает латентно, сопровождаясь длительным вирусоносительством. У молодняка болезнь проявляется спорадически или в виде энзоотических вспышек. У телят и поросят эта болезнь может перейти в опустошительную эпизоотию с острым течением, массовыми пневмониями, высокой летальностью. Отмечены случаи осложнений аденовирусной инфекции микоплазмами, бактериальной микрофлорой и другими вирусами.

Отмечена взаимосвязь течения  аденовирусной инфекции крупного рогатого скота с лейкозом. При обследовании коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств установлено, что серопозитивные коровы на 100% инфицированы аденовирусами.

Течение и симптомы. Инкубационный период у телят составляет 3-4 суток. Течение болезни у молодняка острое, в более старшем возрасте возможно и хроническое.

У телят устанавливают повышение  температуры до 41,5°С, отказ от корма, вначале серозное, а затем слизисто-гнойное истечение из носа, слезотечение, кашель, затрудненное дыхание и понос.

Особенно тяжело болезнь протекает  среди телят 15—20-суточного возраста, у которых выявляют понос с  примесью крови и слизи, сильное  угнетение, дегидратацию организма, гибель 50—60% больных за 1—3 суток болезни. У телят более старшего возраста отмечают кашель, поносы, истощение, отставание в росте и развитии.

Патологоанатомические признаки.  Признаки гемморагического катарального гастроэнтерита, расстройства циркуляции крови. Изменения органов дыхания: уплотнения, ателектаз и эмфизема, пневмония легких.

Строение и размеры  вирионов.  Вирус ,содержит ДНК, белковая оболочка состоит из 252 капсомеров кубической укладки, размеры - 70-90 нм.

Устойчивость вирионов. Аденовирусы устойивы к физико-химическому воздействию, трипсину, эфиру, хлороформу и 50%-ному этиловому спирту, к изменению рН среды. Прогревание при 56°С приводит к полной инактивации через 30 минут. Ультрафиолетовое излучение инактивирует его за 30-60 мин.

Антигенные свойства. Аденовирус крупного рогатого скота представлены девятью серологическими типами. Вирус содержит три растворимых антигена: А, В, С. Антиген А является группоспецифичным, В – белковый компонент 9токсический фактор, вызывающий цитопатогенное действие), С – типоспецифичный. Антигены А и С вызывают образование вируснейтрализующих, комплементсвязывающих, пеципитирующих и антигемагглюттинирующих антител.

Диагноз на аденовирусную инфекцию ставят комплексно на основании клинико-эпизоотологических данных, патологоанатомических изменений и лабораторных исследований.

Лабораторная  диагностика

Патологический материал: прижизненно  – кровь, смывы со слизистой оболочки носовой полости, прямой кишки, с  конъюнктивы;от трупов – кусочки легких и бронхов. Селезенки, лимфоузлов, миндалины, пораженные участки слизистых оболочек носовой и ротовой полостей, трахеи и желудочно-кишечного тракта.

 Схема лабораторной диагностики.

Ι. Экспресс-методы: реакция иммунофлуорисценции (РИФ), реакция гемагглютинации (РГА), обнаружение телец-включений.

ΙΙ. Вирусологические исследования: 1) выделение вируса в культуре клеток текстул бычка, ПЭК или ЛЭК; 2)идентификация выделенного вируса в реакция иммунофлуорисценции (РИФ), реакции связывания комплимента (РСК), реакции диффузной преципитации(РДП), реакции нейтрализации(РН),иммуноферментном анализе (ИФА).

ΙΙΙ.Ретроспективная диагностика: реакция непрямой гемагглютинации(РНГА), реакция связывания комплемента (РСК), реакции диффузной преципитации(РДП), реакция торможения гемагглютинации(РТГА)

Дифференциальный диагноз. Аденовирусную инфекцию, дифференцируют от инфекционного ринотрахеита, респираторно-синтициальной инфекции, вирусной диареи, парагриппа-3, хламидиоза, пастереллеза.

Для специфической профилактики используют инактивированные вакцины из двух штаммов двух серологических групп аденовирусов. Поствакцинальный иммунитет у телят – до 123-127 суток.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы.

1. Сюрин, В.Н. Ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. – М.: Колос, 1984. – 376 с.
2. Госманов Р.Г., Колычев Н.М., Плешакова В. И. /Ветеринарная вирусология: учебник. 3-е изд., перераб и доп. – Спб.: Издательство «Лань», 2010. – 480.: ил. (+ вклейка, 8 с.). – (учебник для вузов. Специальная литература).
3. Коротенко Н.В., Смиян Ю.П, Адаменко А.П. и др./ Справочник специалиста ветеринарной лаборатории; под ред. Смиян Ю.П. – Киев: Урожай, 1987. – 368 с.
4. http://www.kbsu.ru/docs/medf/kmbvi/kmbvi29.doc
5. Учебный портал РУДН. http://web-local.rudn.ru/web-local/disc/?id=3571&rasd_id=44602&v=2260

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Содержание.

1. Структура, размеры и форма вирусов позвоночных животных.
2. Охарактеризуйте субъединичные (молекулярные) вакцины, чем они отличаются от обычных вакцин?
3. Принцип и практическое использование РНГА в вирусологии.
4. Как осуществляется поддержание вирусных штаммов в лабораторных условиях (пассажи, консервация)?
5. Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота.