Шпаргалка по "Вирусологии"

3. Структура, размеры  и форма вирусов позвоночных  животных.

Вирусы  имеют черезвычайно малые размеры. Вирусы – это мельчайшие формы, значительно более мелкие, чем бактерии, и е два превышающие крупные молекулы. Они находятся на границе или за пределами видимости в оптических микроскопах. Размеры их составляют тысячные доли микрона и весьма варьируют у разных вирусов:

• у мельчайших (ящур, полиомиелит) – около 10-25 нм,
• у средних (грипп, парагрипп и др.) – 100-120 нм,
• у крупных (оспа, орнитоз, трахома) – превышают 200нм.

Благодаря ничтожности размеров вирусы проходят через все  мелкопористые бактериальные фильтры. Массу вирусов измеряют в дальтонах: 1 дальтон (Да) - это масса 1 атома водорода, которая равна 1,67∙10^-24г. Размер вирусов измеряется  в нанометрах (нм): 1нм = 10^-3мкм; 1нм = 10 ангстремам (Е).

Вирусы  имеют корпускулярную структуру и определенную для каждого вида морфологию, являясь неклеточной формой жизни. Вирусы имеют следующие основные  морфологические (внешенее строение, вид) формы:

• палочковидная (длина до 250-300 нм, ширина 15 нм);
• сферическая или шарообразная (размеры до 150 нм) – вирусы гриппа, паротита, кори, лейкозов кур и мышей, папиллома кроликов, арбовирусы и др.;
• кубоидальная (у наиболее крупных)- вирусы оспы, эктромелии мышей и др.;
• головчатая , или сперматозоидная (вирусы бактерий);
• нитевидная (на некоторых стадиях развития гриппа).

По данным электронноскопических, рентгенологических и химических исследований центральная часть вируса (нуклеоид или нуклеокапсид) представляет собой нуклеиновую кислоту, упакованную в оболочку (капсиду), образованную из белковых спирализованных нитей или свернувшихся в клубок шаровидных субъединиц – капсомер (греч. capsa – коробка). Капсида состоит из определенного для данного семейства и вида вируса капсомеров, расположенных в ней в определенном порядке и видимых в электронном микроскопе.    

 В зависимости от укладки  капсомеров в капсиде вирусы делят на три группы: 1) вирусы, обладающие спиральной симметрией; 2) вирусы, обладающие икосаэдрической симметрией; 3) вирусы имеющие комбинированную симметрию.    

 Основные компоненты вирусов  – белки и нуклеиновые кислоты.  Сложные по структуре вирусы  содержат еще липиды и углеводы, и некоторые из них – ферменты. В зависимости от вида вируса  содержание каждого компонента  достигает больших различий. Так,  количество белка колеблется  от 50 до 90%, нуклеиновой кислоты –  от 1 до 40, углеводов от 0 до 22, липидов  – от 0 до 50% и более. 
16. Охарактеризуйте субъединичные (молекулярные) вакцины, чем они отличаются от обычных вакцин?

Субъединичные вакцины содержат в своем составе только протективный (защитный)  антиген, против которого в организме вырабатываются вируснейтрализующие антитела. При ряде инфекций (болезнь Марека) субъединичные вакцины готовят из вирусспецифических гликопротеидов клеточных мембран.

Для создания субъединичных вакцин используют  три метода.

Первый метод – получение большого количества вирусов, очистка и выделение иммуногеных субъединиц; это так называемые сплит-вакцины. Однако этот способ является дорогостоящим, и он  вряд ли найдет когда-либо промышленное применение.

Второй метод – химический синтез специфического иммуногена. При его использовании необходимо знание структуры и аминокислотного состава антигенных детерминант. Детерминантные участки, которые включают в себя только несколько аминокислот, могут быть синтезированы химически и соединены с белком-носителем, таким , как бычий сывороточный fm,evby$ затем сцепленный белок используют в качестве вакцины. К сожалению, это требует технологически сложного пептидного синтеза.

Третий метод -  рекомбинативный. Рекомбинативные вакцины получают с помощью биотехнологии. Их изготовление – новое направление в создании генно-инженерных противовирусных вакцин, суть которого состоит во введении в геном крупных вирусов генов протективных белков (противовирусных). В качестве продуцента протективного антигена вируса наиболее часто используют кишечную палочку. В плазмиду кишечной палочки «встраивают» ген вируса, ответственный за синтез протективного антигена. Полученную кишечную палочку культивируют в реакторах, которые синтезируют полипептид вируса. Из бактериальной культуры полипептид вируса выделяют методом молекулярной биологии.

Субединичные вакцины обладают значительными преимуществами по сравнению с традиционными препаратами : они безопасны, так как не содержат вируса, способного вызвать заражение, свободны от вредных примесей, стабильны и не требуют хранения в рефрижераторах. Однако сегодня их главный недостаток – слабые иммуногенные свойства. Для этой целиведется поиск новых адъютантов и иммуностимуляторов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 31. Принцип и практическое использование РН в вирусологии.

Основными составляющими компонентами этой реакции  являются: иммунная вируснейтрализующая (опытная) и нормальная (контрольная) сыворотки одного и того же вида животного или человека; содержащий живые вирусы материал, являющийся антигеном; биологические объекты (мыши, куриные эмбрионы), на которых обнаруживают вируснейтрализующее действие иммунной сыворотки. Применяют два варианта постановки реакции нейтрализации. При одном из них берут постоянную дозу сыворотки и различные разведения вируса, при втором – постоянное разведение вируса и различные разведения сыворотки. Во всех случаях последовательность проведения реакции следующая:

1. предварительный контакт вируссодержащего материала с     соответствующей иммунной сывороткой (один из этих компонентов заведомо известен, наличие другого определяется);
2. введение этой смеси в чувствительную биологическую систему (белым мышам или куриным эмбрионам);
3. учёт наличия или отсутствия нейтрализации.

     Сыворотки получают либо от  больных людей, либо применяют  диагностические сыворотки от  иммунизированных животных. Перед  постановкой реакции сыворотки  инактивируют, прогревая при температуре  56-60⁰С.

      Антигены (вируссодержащие взвеси) получают из материала от больных  вирусными инфекциями, готовят из  органов и тканей заражённых вирусом животных, куриных эмбрионов, а также из инфицированных клеточных культур и подвергают очистке. Перед употреблением антиген титруют для определения его активности.

      Биологические объекты выбирают  с учётом свойств вируса, чувствительности  самого объекта к действию  вируса, а также задач и условий  исследования.

                               Постановка реакции нейтрализации (I вариант)

       Ставят для идентификации выделенного вируса. Для постановки реакции берут два ряда пробирок, из которых первый ряд является опытным, а второй – контрольным. В первый ряд пробирок наливают определённое количество неразведённой диагностической иммунной сыворотки, во второй – контрольный – такое же количество неразведённой нормальной сыворотки того же вида животного. Отдельно в пробирках готовят несколько разведений вируса, чтобы при добавлении их в пробирки опытного, контрольного ряда получились последовательные 10-кратные разведения вируса (например, 10^-1, 10^-2, 10^-3 и т.д.). Сыворотки и добавляемые разведения вируса должны быть в одинаковых объёмах, например по 0,2 мл. Пробирки с приготовленной смесью ставят в термостат при температуре 37⁰С обычно на 1-2 часа. После этого опытные и контрольные смеси вводят мышам или в куриные эмбрионы. Каждым разведением для достоверности опыта заражают не менее 4 мышей или куриных эмбрионов.

      За заражёнными животными (опытными  и контрольными) устанавливают наблюдение  в течение 2-х недель, регистрируют  заболевших и погибших мышей.  Учёт реакции проводят путём  сопоставления количества погибших  опытных и контрольных мышей  от соответствующего разведения  вируса. Определяют 50%-ную смертельную  дозу – LD₅₀, проводя подсчёт по Риду и Менчу. Высчитывают индеек нейтрализации (ИН) по формуле, определяющей количество доз, нейтрализуемых сывороткой:

                   Титр вируса в опыте с нормальной  сывороткой

        ИН = --------------------------------------------------------------------

                      Титр вируса в опыте с иммунной  сывороткой

          ИН менее 10 – отрицательный;

          ИН – 11-49 – сомнительный;

          ИН равный 50 и выше – положительный.

     Заражённые эмбрионы инкубируют  при температуре 35-37⁰С от 48 до 72 ч. Затем яйца вскрывают, аллантоисную или амниотическую жидкость отсасывают и в ней определяют наличие вируса при помощи реакции гемагглютинации. Если гемагглютинация наступила в контроле (смесь нормальной сыворотки с разведениями вируса) и отсутствует в опыте (смесь иммунной сыворотки с разведениями вируса), то сыворотка обладает нейтрализующим действием, Конечный титр вируса в контроле и в опыте определяют путём статистической обработки.

                  Постановка реакции нейтрализации (II вариант)

       Реакцию ставят с различными разведениями исследуемой сыворотки и постоянной дозой известного живого вируса. Для этого к двукратным возрастающим разведениям сыворотки добавляют равные объёмы определённого разведения вируса (рекомендуется брать 100 или 1000 LD₅₀ вируса). Далее поступают как и в I варианте, то есть выдерживают опытные и контрольные смеси 1-2 часа в термостате, после чего вводят их мышам или куриным эмбрионам.

    При постановке реакции нейтрализации  на мышах за титр изучаемой  сыворотки принимают разведение, дающее защитный эффект у 50% мышей. В реакции на куриных  эмбрионах титром сыворотки считается  то наибольшее её разведение, которое ещё способно задержать  гемагглютинирующее действие вирусов у 50% заражённых куриных эмбрионов.

 

 

 

 

 

 

 

44. Как осуществляется поддержание  вирусных штаммов в лабораторных  условиях (пассажи, консервация)?

Пассаж  вируса, проведение микроба (resp. вируса) через организм восприимчивого животного с целью усиления вирулентности; метод впервые предложен Пастером. Животное заражается микробом; затем его убивают или оно гибнет, и из его органов выделяют чистую культуру, вновь заражая ею новое животное и повторяя эту процедуру любое число раз. Можно пассировать также органы, заражая животное культурой микроба и вводя новым животным эмульсию органов зараженного. Чистая культура выделяется только после известного числа пассажей.

Метод размножения  вирусов в культурах клеток: Культура клеток - это клетки многоклеточного  организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне  организма (in vitro). Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение культур клеток, открытие Хуангом (1943) и Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток  (цитопатический эффект) - удобный метод индикации вирусов в культурах клеток, и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и?получения однослойных культур клеток. В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток: первично-трипсинизированные культуры клеток - клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37°С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмического роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция). На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными). Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7-21 дней.

Для культивирования  вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался  монослой). Субкультуры. В вирусологической практике часто используют субкультуры, которые получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2-3 суток формируется монослой. Практически субкультуру можно получить из всех первичных культур клеток. (Хуже субкультивируются куриные фибробласты.) Субкультуры по чувствительности к вирусам не уступают первичным культурам клеток, кроме того, они более экономичны, и есть возможность выявления контаминации клеток вирусами. Субкультуры получают от 2-5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8-10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели. Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток. Перевиваемые культуры клеток - это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды). Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Обычно работа по получению новых клеточных линий продолжается несколько месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых культур клеток - результат генетической изменчивости клеток или селекции единичных клеток, присутствующих в первичной исходной культуре.

Клетки  перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидпый), стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает использование перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин. Перевиваемые культуры клеток можно получать как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Перевиваемые клетки имеют преимущества перед первичными: их приготовление значительно проще, экономятся труд и материальные средства; эти культуры заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные, представляющие смешанную популяцию клеток. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры. Поддерживают перевиваемые клетки путем периодических пересевов. Чаще используют бесцентрифужный метод. Для очередного пересева отбирают 2-3-дневную культуру с хорошим монослоем.