Штаммовая
идентификация микобактерий туберкулеза
Наиболее изученным
методом штаммовой идентификации
микобактерий туберкулеза является
технология, называемая полиморфизмом
длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ,.
или RFLP в английском варианте) и которая
основана на фрагментированин (рестрикции)
ДНК микобактерий туберкулёза ферментом
Pvu II и последующей гибридизации
полученных фрагментов с определёнными
специфическими последовательностями
на ДНК её повторяемого элемента IS6110.
Внутривидовая вариабельность реализуется
за счёт различного числа повторов
IS6110 и их расположения на ДНК. а также
разнообразия расстояний между определёнными
точками атаки фермента рестриктазы
(сайты рестрикции) и элементом IS6110.
Эта технология является весьма сложной
и трудоёмкой. После обработки
ДНК, выделенной из культуры микобактерий
туберкулёза, рестриктазой проводят гельэлектрофорез,
затем переносят фрагменты ДНК
различной длины на нитроцеллюлозную
мембрану, проводят гибридизацию с
фрагментами IS6110-элемента и выявляют
результаты с помощью ферментативной
реакции. Получаемый специфический
рисунок полос характеризует
ДНК конкретного штамма микобактерий
туберкулёза. С помощью компьютерного
анализа выясняется идентичность или
родственность штаммов. Несмотря на то
что метод ПДРФ является наиболее дискриминативным,
т.е. выявляет наибольшее число различий
в анализируемых штаммах, он малоэффективен
при малом числе (менее 5) IS6110-повторов,
наблюдаемых в некоторых штаммах. На рис.
13-14 представлены результаты ПДРФ-типирования
штаммов.
Альтернативой может
быть метод сполиготипирования (spoligotyping)
- анализ полиморфизма спейсерных последовательностей
ДНК - промежуточных между прямыми
повторами DR-области. При проведении
сполиготипирования штаммов проводят
ПЦР с праймерами, ограничивающими
DR-участок, после чего образуются фрагменты
различной длины, которые гибридизуют
с вариабельными промежуточными
участками ДНК. Анализ спейсерных последовательностей
DR-области представляется. по данным
исследователей, более простым, производительным
и пригодным для первичного скрининга
штаммов и предварительного эпидемиологического
анализа, а также исследования непосредственно
клинического материала.
Очевидно, более
эффективным и технологически доступным
методом является VNTR (аббревиатура
английских слов), или метод определения
вариабельного числа точных тандемных
повторов в ДНК микобактерий туберкулёза.
Этот метод основан только на использовании
ПЦР и не требует дополнительных
манипуляций. Поскольку число тандемных
повторов в разных штаммах и в
разных локусах различно, на получаемой
электрофореграмме продуктов ПЦР
определяются и анализируются фрагменты
различного размера. По мнению исследователей,
с помощью VNTR достигается большая
степень дискриминации штаммов,
чем с помощью метода ПДРФ.
Большое внимание в
последние годы уделяется распространению
штаммов микобактерий туберкулёза
семейства W-Beijing (иногда их называют пекинским
штаммом), которые в значительной
части обладают лекарственной устойчивостью.
Основные
требования к качеству молекулярно-биологических
исследований
Основные
нормативные документы при проведении
ПЦР
Приказы Минздрава
России: №45 от 7.02.2000 г.. № 109 от 21.03.2003 г..
№ 64 от 21.02.2000 г. Методические указания:
1.3.1888-04 «Организация работы при исследованиях
методом ПЦР материала, инфицированного
патогенными биологическими агентами
III-IV групп патогенности»; 1.3.1794-03 «Организация
работы при исследованиях методом
ПЦР материала, инфицированного
микроорганизмами I-II групп патогенности».
2003 г.; 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого
материала, инфицированного бактериями
I-IV групп патогенности при работе
методом ПЦР», 2001 г. Приложение 11 к
Инструкции по унифицированным методам
микробиологических исследований при
выявлении, диагностике и лечении туберкулёза.
Персонал
Выполнение молекулярно-биологических
исследований могут проводить врачи
клинической лабораторной диагностики,
врачи-бактериологи, врачи-вирусологи,
биологи клинико-диагностической
лаборатории, а также специалисты
со средним медицинским образованием,
прошедшие специализацию и повышение
квалификации в установленном порядке.
Устройство
помещений лаборатории
Необходимы следующие
лабораторные помещения:
- Зона обработки проб - лаборатория, приспособленная для работы с инфекционными агентами III-IV групп патогенности, согласно Методическим указаниям 13.1888-04.
- Зона для приготовления реакционных смесей ПЦР - лабораторное помещение, в котором предусматривается защита от внутренней лабораторной контаминации - «чистая» зона.
- • Если для анализа продуктов ПЦР используется метод электрофореза, или гибридизации. лабораторное помещение, в котором размноженные фрагменты ДНК извлекаются из амплификационной пробирки и, соответственно, могут попасть в окружающую среду, в соответствии с требованиями к ПЦР-лабораториям (Методические указания 1.3.1794-03, Методические указания 1.3.1888-04) должно быть полностью изолировано от помещений, указанных в предыдущих пунктах. Должно быть исключено перемещение из зоны для электрофореза в зону для обработки проб и «чистую» зону какого-либо персонала, оборудования, любых материалов и предметов, а также перенос воздуха через систему вентиляции или в результате сквозняков. Эта зона не требуется при флуориметрической детекции продуктов ПЦР.
- Помещение для ведения документации и обработки результатов оборудуется компьютерами и необходимой оргтехникой. В этом помещении может располагаться оборудование, обеспечивающее детекцию продуктов ПЦР без вскрытия пробирки. - флюоресцентные ПЦР-детекторы и термоциклеры для ПЦР в реальном времени.
Санитарно-эпидемиологические
требования к первичной обработке
мокроты аналогичны стандартным
микробиологическим требованиям для
работы с микобактериями туберкулёза.
Комплектация
лабораторного оборудования для
ПЦР-диагностики
В комплектацию лаборатории
входит оборудование для следующих
комнат.
- комната пробоподготовки, содержит следующее оборудование: ламинар II класса защиты «СП-1.2»: твёрдотельный термостат с греющейся крышкой для пробирок типа «Эппендорф»; микроцентрифуга на 13 ООО оборотов в минуту; центрифуга («Вортекс»); холодильник с диапазоном температуры от -20 оС до +10 оС; пипетки переменного объёма серии «Рroline»; насос с колбой-ловушкой ОМ-1; штатив для пипеток; штатив рабочее место 200x0,5 мл; штатив рабочее место 50x1.5 мл; штативы для хранения пробирок 80x1.5 мл;
- комната приго<span class="Normal__Char" style=" font-family: 'Times New Roman', 'Arial';
font-size: 14