Анализ крови туберкулезного больного

Штаммовая идентификация микобактерий туберкулеза

Наиболее изученным  методом штаммовой идентификации  микобактерий туберкулеза является технология, называемая полиморфизмом  длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ,. или RFLP в английском варианте) и которая  основана на фрагментированин (рестрикции) ДНК микобактерий туберкулёза ферментом Pvu II и последующей гибридизации полученных фрагментов с определёнными  специфическими последовательностями на ДНК её повторяемого элемента IS6110. Внутривидовая вариабельность реализуется  за счёт различного числа повторов IS6110 и их расположения на ДНК. а также  разнообразия расстояний между определёнными  точками атаки фермента рестриктазы (сайты рестрикции) и элементом IS6110. Эта технология является весьма сложной  и трудоёмкой. После обработки  ДНК, выделенной из культуры микобактерий туберкулёза, рестриктазой проводят гельэлектрофорез, затем переносят фрагменты ДНК  различной длины на нитроцеллюлозную мембрану, проводят гибридизацию с  фрагментами IS6110-элемента и выявляют результаты с помощью ферментативной реакции. Получаемый специфический  рисунок полос характеризует  ДНК конкретного штамма микобактерий туберкулёза. С помощью компьютерного  анализа выясняется идентичность или родственность штаммов. Несмотря на то что метод ПДРФ является наиболее дискриминативным, т.е. выявляет наибольшее число различий в анализируемых штаммах, он малоэффективен при малом числе (менее 5) IS6110-повторов, наблюдаемых в некоторых штаммах. На рис. 13-14 представлены результаты ПДРФ-типирования штаммов.

Альтернативой может  быть метод сполиготипирования (spoligotyping) - анализ полиморфизма спейсерных последовательностей  ДНК - промежуточных между прямыми  повторами DR-области. При проведении сполиготипирования штаммов проводят ПЦР с праймерами, ограничивающими DR-участок, после чего образуются фрагменты  различной длины, которые гибридизуют  с вариабельными промежуточными участками ДНК. Анализ спейсерных последовательностей DR-области представляется. по данным исследователей, более простым, производительным и пригодным для первичного скрининга  штаммов и предварительного эпидемиологического  анализа, а также исследования непосредственно  клинического материала.

Очевидно, более  эффективным и технологически доступным  методом является VNTR (аббревиатура английских слов), или метод определения  вариабельного числа точных тандемных  повторов в ДНК микобактерий туберкулёза. Этот метод основан только на использовании  ПЦР и не требует дополнительных манипуляций. Поскольку число тандемных  повторов в разных штаммах и в  разных локусах различно, на получаемой электрофореграмме продуктов ПЦР  определяются и анализируются фрагменты  различного размера. По мнению исследователей, с помощью VNTR достигается большая  степень дискриминации штаммов, чем с помощью метода ПДРФ.

Большое внимание в  последние годы уделяется распространению  штаммов микобактерий туберкулёза  семейства W-Beijing (иногда их называют пекинским  штаммом), которые в значительной части обладают лекарственной устойчивостью.

Основные  требования к качеству молекулярно-биологических  исследований

Основные  нормативные документы при проведении ПЦР

Приказы Минздрава  России: №45 от 7.02.2000 г.. № 109 от 21.03.2003 г.. № 64 от 21.02.2000 г. Методические указания: 1.3.1888-04 «Организация работы при исследованиях  методом ПЦР материала, инфицированного  патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности»; 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом  ПЦР материала, инфицированного  микроорганизмами I-II групп патогенности». 2003 г.; 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности при работе методом ПЦР», 2001 г. Приложение 11 к  Инструкции по унифицированным методам  микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза.

Персонал

Выполнение молекулярно-биологических  исследований могут проводить врачи  клинической лабораторной диагностики, врачи-бактериологи, врачи-вирусологи, биологи клинико-диагностической  лаборатории, а также специалисты  со средним медицинским образованием, прошедшие специализацию и повышение  квалификации в установленном порядке.

Устройство  помещений лаборатории

Необходимы следующие  лабораторные помещения:

• Зона обработки проб - лаборатория, приспособленная для работы с инфекционными агентами III-IV групп патогенности, согласно Методическим указаниям 13.1888-04.
• Зона для приготовления реакционных смесей ПЦР - лабораторное помещение, в котором предусматривается защита от внутренней лабораторной контаминации - «чистая» зона.
• • Если для анализа продуктов ПЦР используется метод электрофореза, или гибридизации. лабораторное помещение, в котором размноженные фрагменты ДНК извлекаются из амплификационной пробирки и, соответственно, могут попасть в окружающую среду, в соответствии с требованиями к ПЦР-лабораториям (Методические указания 1.3.1794-03, Методические указания 1.3.1888-04) должно быть полностью изолировано от помещений, указанных в предыдущих пунктах. Должно быть исключено перемещение из зоны для электрофореза в зону для обработки проб и «чистую» зону какого-либо персонала, оборудования, любых материалов и предметов, а также перенос воздуха через систему вентиляции или в результате сквозняков. Эта зона не требуется при флуориметрической детекции продуктов ПЦР.
• Помещение для ведения документации и обработки результатов оборудуется компьютерами и необходимой оргтехникой. В этом помещении может располагаться оборудование, обеспечивающее детекцию продуктов ПЦР без вскрытия пробирки. - флюоресцентные ПЦР-детекторы и термоциклеры для ПЦР в реальном времени.

Санитарно-эпидемиологические требования к первичной обработке  мокроты аналогичны стандартным  микробиологическим требованиям для  работы с микобактериями туберкулёза.

Комплектация  лабораторного оборудования для  ПЦР-диагностики

В комплектацию лаборатории  входит оборудование для следующих  комнат.

• комната пробоподготовки, содержит следующее оборудование: ламинар II класса защиты «СП-1.2»: твёрдотельный термостат с греющейся крышкой для пробирок типа «Эппендорф»; микроцентрифуга на 13 ООО оборотов в минуту; центрифуга («Вортекс»); холодильник с диапазоном температуры от -20 ^оС до +10 ^оС; пипетки переменного объёма серии «Рroline»; насос с колбой-ловушкой ОМ-1; штатив для пипеток; штатив рабочее место 200x0,5 мл; штатив рабочее место 50x1.5 мл; штативы для хранения пробирок 80x1.5 мл;
• комната приго<span class="Normal__Char" style=" font-family: 'Times New Roman', 'Arial'; font-size: 14