Анализ крови туберкулезного больного

Индукция  синтеза гамма-интерферона in vitro

Гамма-интерферон (ИФН-γ) - фактор специфической иммунной защиты, реализующейся посредством активирования  ферментных систем макрофагов. Индукцию синтеза ИФН-γ сенсибилизированными Т-лимфоцитами вызывает их взаимодействие с антигенами микобактерий.

В качестве антигенов  используют как туберкулин ППД. так  и специфические антигены, полученные генно-инженерным путём, в частности  антигены ESAT-6 (ранний секретируемый  антиген с молекулярной массой 6 кДа) и CFP-10 (белок культурального фильтрата, 10 кДа). Генно-инженерные или рекомбинантные антигены отсутствуют в клетках  вакцины БЦЖ и других микобактерий. При использовании туберкулина  результаты теста индукции ИФН-γ  сопоставимы с результатами туберкулинового  кожного теста (прямая корреляция). При использовании генно-инженерных антигенов результаты теста более  специфичны и не зависят от предшествующей вакцинации БЦЖ. При обследовании вакцинированных  лиц, не имевших контакта с туберкулёзной  инфекцией, специфичность теста  составляет 99%. Чувствительность теста  среди больных туберкулёзом колеблется от 81 до 89%.

Разработаны тесты  и диагностикумы, основанные на краткосрочном  культивировании клеток цельной  крови или мононуклеарных клеток, выделенных из крови, с антигенами микобактерий туберкулёза in vitro с последующим  определением концентрации ИФН-γ или  подсчётом числа Т-лимфоцитов, синтезирующих  ИФН-γ. Концентрацию интерферона, синтезированного в пробирке, определяют методом ИФА  с использованием моноклональных антител, связывающих ИФН-γ. Затем с помощью  калибровки стандартного ИФН-γ определяют его концентрацию в пробирке или  лунках планшета.

При проведении теста Elispot количество Т-лимоцитов, синтезирующих  ИФН-γ. подсчитывают на поверхности  чашки, покрытой антителами к ИФН-γ.

разработчики диагностикума  на основе индукции ИФН-γ in vitro, который  утверждён Агентством по лекарствам и продуктам США, утверждают, что  с помощью теста невозможно дифференцировать латентную туберкулёзную инфекцию от активного туберкулёза. Поэтому  в регионах с высоким уровнем  инфицированности тест не имеет прямого  диагностического значения. Однако в  нашей стране его можно применять  для дифференцирования туберкулёзной  инфекции у детей от поствакцинальной аллергии, а также для оценки уровня специфического иммунитета в процессе лечения.

В настоящее время  проходит стадию изучения отечественная  тест-система для определения  индукции синтеза ИФН-γ специфическими туберкулёзными антигенами in vitro.

Иммунный  статус и течение туберкулёза, иммунокоррекция

В процессе лечения  туберкулёза у людей происходят изменения антигенемии и состояния  иммунной системы.

Данные об изменениях в экссудатах и тканях в значительной мере противоречивы. Единственное, что  можно отметить с полным основанием, - это то, что в туберкулёзных  гранулёмах, как правило, обнаруживается значительное число активированных Т-лимфоцитов.

Имеет смысл остановиться ещё на двух положениях, которые  необходимы, чтобы понять роль иммунологических механизмов в лечении туберкулёза  у человека:

• у больных СПИДом особенно высока частота развития множественной лекарственной устойчивости;
• при множественной лекарственной устойчивости (и в отсутствие ВИЧ-инфекции) нарушения иммунитета (в первую очередь Т-клеточного звена) особенно существенны.

При туберкулёзе  широко применяют различные методы иммунокоррекции: это в первую очередь  препараты, действующие преимущественно  на Т-клеточный иммунитет и систему  мононуклеарных фагоцитов (гормоны  тимуса, изофон, ликопид, полиоксидоний  и др.). а также цельные (аттенуированные) микобактерии и их компоненты.

Молекулярно-биологическая  диагностика туберкулеза

К методам молекулярной биологии в диагностике инфекционных заболеваний относят, в основном, методы, основанные на манипулировании  с геномными материалами бактериальных  и вирусных возбудителей с целью  выявления специфического генетического  материала - участков ДНК с нуклеотидной последовательностью, специфической  в отношении данного вида или  штаммов возбудителя, для анализа  специфических последовательностей  ДНК в генах, определяющих чувствительность возбудителя к определённым лекарственным  веществам, а также для анализа  функциональной активности определённых генов возбудителя. Молекулярно-биологические  методы получили большое распространение  в научных исследования и практическое применение в диагностике и контроле различных бактериальных и вирусных инфекций после открытия в 1985 г. Кэрри  Мюллисом (лауреат Нобелевской премии. 1989) полимеразной цепной реакции.

Принципы  и возможности метода полимеразной цепной реакции

ПЦР позволяет амплифицировать (размножить) в пробирке нуклеотидную последовательность (фрагмент ДНК возбудителя) в течение нескольких часов в  миллионы раз. Проведение реакции при  наличии единичных цепей ДНК  определяет исключительно высокую  чувствительность анализа.

Нуклеотидная последовательность определённых участков в цепи ДНК  определяет генетическое своеобразие  микроорганизма, что объясняет высокую  специфичность ПЦР.

Значение этого  метода для обнаружения и исследования характеристик микобактерий туберкулёза  обусловлено биологическими особенностями  микроорганизма, обладающего очень  медленным ростом: время удвоения ДНК микобактерий туберкулёза при  их культивировании составляет 12-24 ч.

Принцип метода ПЦР  состоит в амплификации - многократном, в миллионы раз. умножении участков специфической последовательности ДНК в пробирочном микрообъёме  при циклическом повторении следующих  трёх стадий реакции, каждая из которых  проходит в различном температурном  режиме:

• I стадия - денатурация двухцепочечной ДНК при нагревании с расхождением её цепей;
• II стадия - комплементарное связывание (гибридизация) праймеров (затравочных олигонуклеотидов) с концевыми участками цепей строго специфического, избранного для умножения фрагмента ДНК;
• III стадия - достройка цепи фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы.

Для амплификации в  пробирке должны быть молекулы матричной  ДНК. четыре вида дезоксинуклеозидтрифосфатов (нуклеотидов), содержащих соответствующие  азотистые основания: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц); искусственно синтезированные затравочные олигонуклеотиды  (праймеры), состоящие из 18-20 пар оснований; термостабильный фермент ДНК-полимераза, имеющий температурный оптимум 68-72 ^оС, и ионы магния.

Специфичность ПЦР  зависит от выбора фрагмента ДНК. В соответствии с ним синтезируют  фланговые затравочные олигонуклеотиды. Специфичность гибридизации и достройки  цепи ДНК обусловлена принципом  комплементарности следующих пар  азотистых оснований: аденин-тимин, гуанин-цитозин.

Для определения  генома микобактерий туберкулёзного комплекса  наиболее эффективной мишенью амплификации в большинстве тест-систем избран фрагмент ДНК IS6110, который в большинстве  штаммов микобактерий туберкулёза  имеет в геноме значительное число (10-20) повторов, что обеспечивает, наряду со специфичностью, высокую чувствительность анализа. В то же время описаны  штаммы микобактерий туберкулёза с  малым числом повторов или отсутствием  фрагмента IS6110.

Выделение молекул ДНК из биологического образца

Для проведения ПЦР  молекулы ДНК возбудителя должны быть выделены из биологического материала  в минимальном объёме, при минимальном  количестве неспепифической ДНК  и различных ингибиторов фермента - ДНК-полимеразы.

Подготовка проб должна проводиться в условиях, предотвращающих  перекрёстное загрязнение исследуемых  образцов выделяемыми молекулами ДНК. Для этого необходима предварительная  обработка помещения ультрафиолетом, полов и рабочих поверхностей столов и приборов - хлорсодержащими  растворами. Также необходимо обязательное использование чистых перчаток, одноразовых  пробирок и наконечников к автоматическим пипеткам.

Для выделения ДНК  микобактерий туберкулёза из клинических  образцов (спинномозговая жидкость, бронхиальный смыв), не содержащих большого числа  лейкоцитов, клеточного детрита или  солей, достаточно центрифугировать пробу  при 3-4 тыс. оборотов в минуту, добавить к осадку 20-30 мкл 2% раствора тритона  Х-100 и прогреть при 90 ^оС в течение 30 мин.

Для подготовки проб мокроты необходимо эффективное  разжижение, для которого обычно используют 4% раствор натрия гидроксида и N-ацетил-L-цистеин (NALC) в количестве 50-80 мг на пробу - в  зависимости от вязкости образца. Раствор NALC должен быть приготовлен ex tempore либо порошок NALC можно добавить в сухом  виде непосредственно в пробу. После  разжижения необходимо центрифугирование  проб в течение 15 мин при 3,5-4 тыс. оборотов в минуту (3000 g) в пробирках  объёмом 50 мл с завинчивающимися крышками, т.е. в тех же условиях, которые  рекомендуются для предпосевной подготовки мокроты.

Для экстракции ДНК  из осадка чаще применяют метод, основанный на использовании 5-6-молярного раствора гуанидин-изотиоцианата в качестве лизирующего реагента и микропористых частиц оксида кремния («диатомовая земля»), сорбирующих молекулы ДНК. Неспецифические вещества, в том числе возможные ингибиторы, затем отмывают в 2,5-молярном растворе гуанидин-изотиоцианата и растворе этанола, после чего десорбируют молекулы ДНК в воде, и эти образцы используют для проведения ПЦР. Для упрощения технологии выделения ДНК «диатомовую землю» нередко заменяют магнитными микрочастицами, покрытыми оксидом кремния. При этом для осаждения частиц вместо центрифугирования применяют специальный магнитный штатив для микропробирок.

В России разработан оригинальный метод иммуномагнитной  сепарации микобактерий с последующей  экстракцией ДНК возбудителя. Для  иммуномагнитной сепарации микобактерий туберкулёза используют феррочастицы размером 3-5 мкм, покрытые оксидом кремния, к которым присоединены посредством  химической связи поликлональные (кроличьи) антитела к микобактериям туберкулёза. Образцы мокроты после щелочного  лизиса нейтрализуют кислым раствором  трис-HCl и инкубируют с иммуномагнитным  сорбентом. Затем иммуноферрочастицы собирают с помощью магнитной  палочки со сменным наконечником, переносят в микропробирку, осаждают. вносят 20-30 мкл 2% раствора тритона Х-100 и прогревают 30 мин при 90 ^oС. Надосадочную жидкость используют в качестве ДНК-матрицы для ПЦР-анализа.

Сложной проблемой  является выделение ДНК микобактерий туберкулёза из биоптатов. Для лизиса биоптата используют фермент - протеиназу К в конечной концентрации 200-500 мг/л  при температуре 56 ^oС в течение ночи. Далее выделяют одним из известных методов. Избыток неспецифической ДНК при ПЦР-анализе биоптатов нередко служит причиной ингибирования реакции, что требует повторного экстрагирования ДНК.

Методы  детекции результатов

После завершения реакции  амплифицированные фрагменты ДНК  возбудителя идентифицируют с помощью  различных методов.

Хорошо известен метод гельэлектрофореза. При этом полученный фрагмент ДНК идентифицируют по положительному контролю, содержащему  искомый специфический фрагмент ДНК, или по заранее известному размеру (числу нуклеотидных пар) фрагмента, который определяют с помощью  стандартного молекулярного маркёра.

В присутствии специфического красителя - этидия бромида, включающегося  в двухцепочечную ДНК. синтезированный  фрагмент ДНК выявляется в виде светящейся под действием ультрафиолета  полосы.

Размер фрагмента  ДНК, определяемый при электрофорезе  по расстоянию пробега от старта, должен соответствовать известному маркёру  молекулярного веса или положительному контролю.

Другие методы определения  результатов ПЦР основаны на гибридизации одно-цепочечных продуктов ПЦР с  комплементарным к ним олигонуклеотидом - ДНК-зондом, меченным биотином, с последующей  детекцией с помощью ферментативной реакции посредством, например, связывания с биотином конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза.

На основе такого типа детекции созданы ПЦР-анализаторы, в которых детекция результатов  ПЦР проводится автоматически в  результате считывания оптической плотности  в образцах после проявления ферментативной реакции.

Недостатки указанных  методов заключаются в возможностях внутрилабораторной контаминации довольно короткими фрагментами молекул  ДНК. Эти молекулы при попадании  во вновь исследуемые образцы  становятся матрицей для ПЦР и  приводят к ложноположительным результатам.

В связи с этим для предотвращения ложноположительных результатов вводятся жёсткие правила  разделения и изолирования помещений: для выделения ДНК из биологических  образцов; помещения для детекции результатов (электрофорезная) от чистой зоны. Эти помещения представляют собой зону вероятной контаминации. Другая изолированная зона - чистое помещение для внесения исследуемых  образцов ДНК в пробирки с реакционной  смесью для проведения ПЦР. И наконец, предполагается, что основной прибор - ДНК-амплификатор - должен быть вынесен  в отдельное, возможно офисное, помещение.