В 2001 г. критические
концентрации были предложены для следующих
препаратов 2-го ряда (для критической
пропорции в 1%):
- капреомицин - 40 мкг/мл;
- протионамид - 40 мкг/мл;
- канамицин - 30 мкг/мл;
- виомицин - 30 мкг/мл;
- циклосерин - 40 мкг/мл;
- аминосалициловая кислота - 0,5 мкг/мл;
- офлоксацин - 2 мкг/мл.
Результаты роста
оценивают через 4 нед как предварительный
и через 6 нед культивирования - как
окончательный.
Для определения
лекарственной чувствительности к
пиразинамиду, который широко используют
в современной химиотерапии туберкулёза,
рекомендуемая критическая концентрация
составляет 200 мкг/мл. Однако до сих
пор нет общепринятого метода
определения лекарственной устойчивости
к этому препарату на твёрдых
питательных средах, поскольку его
антибактериальная активность проявляется
только в кислой среде (pH <6), что
технически трудно выдержать. К тому
же многие клинические культуры микобактерий
туберкулёза неохотно растут на яичных
средах с кислой средой.
Чтобы оценить качество
результатов определения лекарственной
чувствительности микобактерий, рекомендовано
каждую новую партию среды Левенштейна-Йенсена
контролировать параллельным определением
чувствительности стандартного музейного
штамма H37Rv. Кроме того, существуют определённые
микробиологические критерии, которые
необходимо выдерживать, чтобы методики
давали хорошо воспроизводимый и
правильно интерпретируемый результат.
К таким можно отнести жизнеспособность
культуры микобактерий туберкулёза, правила
получения гомогенной взвеси и суспензии,
правила отбора культур микобактерий
туберкулёза, репрезентативность отобранной
бактериальной массы. Достоверность
определения лекарственной устойчивости
снижается при чрезвычайно скудном
бактериовыделении.
В последнее время
перспективным признан метод
определения лекарственной чувствительности
с помощью автоматизированных систем.
Наиболее совершенным в этой области
являются разработки на основе ВАСТЕС
MGIT-960. В этом случае лекарственную
чувствительность микобактерий туберкулёза
определяют на основе модифицированного
метода пропорций. В процессе определения
происходит сравнение скорости роста
микобактерий туберкулёза в контрольной
пробирке и в пробирках с лекарственными
препаратами. Для определения чувствительности
к стрептомицину, изониазиду, рифам-пицину
и этамбутолу используют обогащающие
добавки и антибиотики, входящие
в набор SIRE kit. Для определения
чувствительности к пиразинамиду используют
набор PZA kit. В ходе выполнения теста
суспензией микобактерий туберкулёза
инокулируются тестовые пробирки с
лекарственными препаратами, а также
контрольные пробирки с разведением
суспензии в 100 раз для всех препаратов,
за исключением пиразинамида, где
разведение суспензии составляет 10
раз. Критерием устойчивости служит
индикатор роста микобактерий величиной
в 100 GU при достижении роста в контрольной
пробирке 400 GU (см. «Культуральные методы
выделения микобактерий»). Учёт и
интерпретация результатов ведутся
автоматически и задаются вводимой
или выбранной программой.
В качестве критических
концентраций используют финальные
концентрации в тестовой пробирке с
жидкой питательной средой. В настоящее
время разработаны критические
концентрации как к препаратам 1-го
ряда, так и к некоторым препаратам
2-го ряда. Необходимо отметить, что
определение чувствительности микобактерий
туберкулёза к циклосерину и
аминосалициловой кислоте выполняют
только на яичных питательных средах.
Детально разработанный
протокол работы по описанной системе
позволяет проводить исследование
лекарственной чувствительности как
на выделенной культуре (с плотной
питательной средой), так и с
использованием первичного роста микобактерии
в MGIT-пробирке. Последний вариант
существенно сокращает время
проведения культуральных исследований,
позволяя получить полные результаты
о культуре микобактерий туберкулёза
(включая сведения о лекарственной
чувствительности) уже через 3 нед
с момента сбора материала, в
то время как традиционным методом
это удаётся получить лишь к 3-му
месяцу. Вовремя полученные результаты,
когда больной находится в
интенсивной фазе лечения, могут
компенсировать относительную дороговизну
исследований.
Дифференциация
микобактерий
С учётом того, что
используемые питательные среды
не являются строго селективными. последующую
дифференциацию выделенных микобактерий
признают обязательной. Необходимость
дифференциации микобактерий обусловлена
рядом особенностей патологических
процессов, вызываемых представителями
рода: различным течением и исходом
туберкулёза и микобактериозов,
наличием природной лекарственной
резистентности к некоторым противотуберкулёзным
препаратам.
Признано, что первичную
идентификацию микобактерий комплекса
М. tuberculosis от нетуберкулёзных микобактерий
осуществляют по следующим характеристикам:
скорость роста на плотных питательных
средах, пигментообразование, морфология
колоний, наличие кислотоустойчивости
и температурный оптимум роста.
К сожалению, не существует
какого-либо одного лабораторного метода,
позволяющего с достоверностью отличить
микобактерии комплекса М. tuberculosis от
других кислотоустойчивых микобактерий,
тем не менее сочетание вышеописанных
признаков с результатами ряда приводимых
ниже биохимических тестов позволяет
провести идентификацию микобактерий
комплекса М. tuberculosis с вероятностью
до 95%.
Для дифференциации
микобактерий комплекса М. tuberculosis (М.
tuberculosis, М. bovis, М. bovisBCG, М. africanum, М. microti, М.
canettii и других) от медленно растущих
нетуберкулёзных микобактерий применяют
основные биохимические тесты, выявляющие
наличие следующих признаков:
- способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест):
- нитратредуктазной активности;
- термостабильной каталазы;
- роста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл).
В качестве дополнительных
можно использовать также тесты
роста на среде, содержащей 500 мкг/мл
паранитробензойной кислоты или 5% хлорида
натрия.
Многие бактериологические
лаборатории идентифицируют эти
микроорганизмы лишь на уровне комплекса,
что обусловлено ограниченными
возможностями лабораторий и
методическими возможностями специалистов.
В большинстве же
случаев на практике для дифференциации
М. tuberculosis и М. bovis бывает достаточно
следующих тестов: ниацинового, на наличие
нитратредуктазы, на наличие пиразинамидазы
и регистрации роста на среде,
содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2-карбоксиловой
кислоты. При этом учитывают, что
микобактерии комплекса М. tuberculosis характеризуются
следующей совокупностью признаков:
- медленным ростом (более 3 нед);
- температурой роста в пределах 35-37 oС;
- отсутствием пигментообразования (цвет слоновой кости);
- выраженной кислотоустойчивой окраской;
- положительным ниациновым тестом;
- положительным нитратредуктазным тестом;
- отсутствием термостабильной каталазы (68 oС).
- отсутствием роста на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей:
- 1000 мкг/мл натрия салициловокислого,
- 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты,
- 5% хлорида натрия:
- ростом в присутствии 1-5 мкг/мл тиофен-2-карбоксиловой кислоты.
Актуальность дифференциации
выделенных микобактерий будет заметно
возрастать с ростом частоты регистрации
случаев ВИЧ/СПИДа, ассоциированных
с туберкулёзом или микобактериозами.
В настоящее время нет абсолютной
уверенности готовности практических
региональных лабораторий корректно
выполнять данный объём работ.
Иммунологическая
диагностика туберкулеза
Существует целый
ряд универсальных феноменов, препаратов
и иммунологических тестов, которые
первоначально были обнаружены именно
при туберкулёзе или на модели
иммунного ответа на микобактерии.
К ним относят БЦЖ и туберкулин,
такой феномен, как кожная ГЗТ (туберкулиновые
пробы - реакции Пирке и Манту),
реакцию на подкожное введение туберкулина
сенсибилизированным животным (феномен
Коха). Одни из первых антитела при инфекционном
заболевании были также обнаружены
при туберкулёзе. Разумеется, чем
глубже понимание механизмов противотуберкулёзного
иммунитета и их генетического контроля,
тем шире может быть использование
иммунологических методов и препаратов,
воздействующих на иммунитет, для решения
практических проблем фтизиатрии.
Самой важной и сложной
практической проблемой в настоящее
время считают выявление туберкулёза
в процессе массового скрининга
населения. Однако, несмотря на многочисленные
сообщения об «успехах» (на ограниченном
материале), нет подходящего для
этих целей иммунологического метода
(воспроизводимого в «любых руках»)
и препарата.
Иммунологические
методы, в частности серологические
исследования (определение антигенов,
антител) и туберкулинопровокационные
пробы, весьма широко используются в
клинической практике.
На первом месте
среди иммунологических исследований,
применяемых при дифференциальной
диагностике, находятся серологические
методы - определение антигенов и
антител в разных средах организма.
Специфичность определения
антител к микобактериям туберкулёза
зависит от используемых при иммунном
анализе антигенов. Предложено значительное
количество антигенов, самый первый
из которых - туберкулин ППД:
- ППД и другие комплексные препараты из культуральной жидкости;
- ультразвуковой дезинтеграт;
- тритоновый экстракт и другие комплексные препараты клеточных стенок;
- 5-антиген (Daniel);
- 60-антиген (Coccito);
- липоарабиноманнан;
- корд-фактор (трегалоза-6,6-ди-миколат);
- фенольный и другие гликолипиды;
- липополисахариды;
- фибронектинсвязывающий антиген;
- белки (чаще всего рекомбинантные); 81,65,38,34,30,19,18,16,15.12 КДА и др.
В результате многолетних
исследований российских и зарубежных
учёных были выявлены основные закономерности
антителообразования и эффективности
серологической диагностики туберкулёза:
чем более комплексный антиген,
тем выше чувствительность и ниже
специфичность тестов. Специфичность
в разных странах различается
в зависимости от инфицированности
населения М. tuberculosis и нетуберкулёзными
микобактериями, от проведения вакцинации
БЦЖ и др. У детей информативность
серодиагностики ниже, чем у взрослых.
При первичном туберкулёзе (чаще
дети) более информативно определение
IgM. при вторичном - IgG. У ВИЧ-ннфицированных
информативность серодиагностики
при определении антител снижается.
Эффективность определения антител
зависит от ряда «клинических моментов»:
активности процесса (наличия или
отсутствия «выделения» микобактерий,
наличия полостей распада, степени
инфильтрации), распространённости процесса,
длительности его течения.
Чувствительность
метода иммуноферментного анализа
(ИФА) составляет около 70%. Недостаточная
эффективность исследования связана
с его низкой специфичностью. Ранее
рассматривали возможности применения
серологического скрининга в группах
высокого риска, в частности среди лиц
с посттуберкулёзными изменениями в лёгких.
Для повышения специфичности
ИФА продолжают поиски более специфичных
антигенов, в том числе получаемых
генно-инженерным путём: ESAT-6 и др. (см.
выше). Применение строго специфичных
антигенов (38 кДа, ESAT) повышает специфичность.
но значительно уменьшает чувствительность
анализа. Наряду с ИФА (экспериментальные
лабораторные тест-системы. например Pathozyme
ELISA kit) предложены также наборы иммунохроматографические
с латеральной фильтрацией (Mycodot),
а также другие подобные тесты (дот-анализ
на мембране) с визуальной оценкой
результата исследования. При проведении
этих тестов анализ проходит в течение
10-30 мин; они не требуют специального
оборудования, требуют визуальной оценки
результатов, что связано с известной
субъективностью. Указанные методы
имеют примерно те же характеристики
чувствительности и специфичности
(70% и 90-93% соответственно), что и традиционный
ИФА.
Применение методов
иммунного анализа имеет определённое
значение в качестве дополнительного,
учитываемого в комплексе используемых
методов, при дифференциальной диагностике
туберкулёза, особенно при диагностике
его внелёгочных форм. Наибольшую
эффективность метод ИФА имеет
в диагностике туберкулёзного менингита
при исследовании спинномозговой жидкости.
В этом случае чувствительность анализа
составляет 80-85%, а специфичность 97-98%.
Имеются сведения об эффективности
определения антител к микобактериям
туберкулёза в слёзной жидкости
при диагностике туберкулёзного
увеита.