Анализ крови туберкулезного больного

Для предотвращения контаминации продуктами предшествующих реакций - амп-ликонами некоторые ПЦР-тест-системы  вместо дезоксинуклеозидтимидина содержат дезоксинуклеозидуридин, который при  синтезе цепи in vitro встраивается вместо него в соответствующую позицию, т.е. азотистое основание тимин, присутствующий в нативной ДНК, замещается на урацил. Урацил-ДНК-гликозилаза, добавляемая  в реакционную смесь к анализируемому материалу, разрушает только контаминирующие  фрагменты с дезоксиуридином, но не нативную анализируемую ДНК. содержащую дезокситимидин. Последующее прогревание  при 94 ^oС инактивирует этот фермент и не препятствует амплификации в ПЦР.

Существует тест-система, основанная на изотермальной амплификации рРНК, для чего проводят вначале  обратную транскрипцию и синтез молекул  ДНК. являющихся, в свою очередь, матрицей для последующего синтеза молекул  РНК. Ампликоны РНК детектируются  с помощью окрашенного акридином  ДНК-зонда при гибридизации в  растворе реакционной пробирки. Этот метод, помимо высокой чувствительности, имеет преимущество проведения анализа  в одной пробирке, что предотвращает  контаминацию. По данным авторов, чувствительность этого метода в респираторных  образцах достигает 90% при специфичности 99-100%.

Новые методы детекции реализованы в ПЦР в режиме реального времени. Эти методы отличаются прежде всего тем, что ПЦР и  детекция её результатов осуществляются одновременно в одной закрытой пробирке. Это не только технологически упрощает методику проведения анализа, но и предотвращает контаминацию лабораторных помещений и исследуемых образцов продуктами предшествующих ПЦР.

При ПЦР в реальном времени детекция результатов происходит за счет флюоресценции, возникающей  при гибридизации флюорогенного  ДНК-зонда с амплифици-руемым в  ходе ПЦР специфическим фрагментом ДНК. Структура флюорогенных ДНК-зондов построена таким образом, что  флюоресцентный маркёр высвобождается в результате ферментативной реакции  или дистанцируется от молекулы гасителя флюоресценции только при специфической  гибридизации с искомой молекулой  ДНК, амплифицируемой в ходе ПЦР. При росте числа гибридизированных  с зондом молекул возрастание  флюоресценции до детектируемого уровня пропорционально числу молекул  амплифицированного продукта. Поскольку  при каждом цикле ПЦР количество молекул фрагмента ДНК умножается вдвое, номер цикла, с которого флюоресценция  определяется и возрастает, обратно  пропорционален числу молекул ДНК  в исходном образце. Если в реакцию  ввести в качестве калибратора несколько  различных известных концентраций молекул соответствующего фрагмента  ДНК микобактерий туберкулёза, то с  помощью компьютерной программы  может быть рассчитано и количество геномов ДНК в исследуемом  материале.

Каждый стандартный  образец дублирован. Количественный критерий - минимальное число циклов ПЦР, необходимое для начала и  роста определяемой флюоресценции. По оси абсцисс - количество циклов; по оси ординат - величина флюоресценции. Концентрации ДНК обратно пропорциональны  числу циклов, необходимых для  появления флюоресценции. В окнах  правой колонки (21-32) отмечены номера циклов для соответствующих концентраций. Различия между 10-кратными концентрациями фрагментов ДНК 10²-10⁶мл - 3.2-3.4 цикла. Для двух пациентов концентрации фрагментов IS6110 составили около 10³/мл и 10⁴/мл. С учётом числа повторов (6-20) анализируемых фрагментов в геноме микобактерий туберкулёза число мико-бактерий в клинических образцах - около 100 и 1000 клеток соответственно.

Применение  ПЦР в диагностике туберкулёза

Метод ПЦР в наибольшей степени применяется для ускоренной диагностики туберкулёза - обнаружения  микобактерий туберкулёза в клинических  образцах: мокроте. промывных водах  бронхов, плевральном экссудате, моче, спинномозговой жидкости, пунктатах  остеолизиса, аспиратах женских  половых путей и различных  биоптатах. При исследовании в Голландии  около 500 образцов мокроты и бронхиальных смывов от 340 больных с подтверждённым диагнозом туберкулёза лёгких были изучены сравнительная чувствительность методов ПЦР, культурального исследования и микроскопии мазков. Чувствительность анализа составила 92,6,88,9 и 52,4% соответственно. При этом специфичность всех методов  была около 99%.

Проведено сравнение  эффективности обнаружения микобактерий туберкулёза методами микроскопии  мазков, посева на среду Левенштейна-Йенсена, тест-системы ВАСТЕС и ПЦР-анализа. ПЦР демонстрировала чувствительность 74,4%, микроскопия - 33,8%, посев на плотную  среду - 48,9% и ВАСТЕС - 55,8%. Среднее  время детекции для посева на среде  Левенштейна-Йенсена - 24 дня. ВАСТЕС - 13 дней, ПЦР - 1 день.

Возможности применения ПЦР в качестве чувствительного  и быстрого метода контроля эффективности  лечения туберкулёза также обсуждаются.

Обнаружение ДНК  микобактерий туберкулёза методом  ПЦР при эффективной химиотерапии определяется в течение более  длительного времени - в среднем  на 1,7 мес по сравнению с бактериовыделением, определяемым при люминесцентной микроскопии, и на 2,5 мес по сравнению с бактериологическим исследованием.

Диагностика внелегочных форм туберкулеза

Значение ПЦР  как чувствительного метода особенно велико для внелёгочных форм, поскольку  именно при этих формах клинико-рентгенологические методы и традиционные бактериологические методы определения микобактерий туберкулёза  в диагностических материалах малоэффективны.

При исследовании образцов мочи результаты ПЦР-анализа были положительными у 16 из 17 больных активным туберкулёзом мочевой системы и отрицательными у 4 больных неактивным туберкулёзом почек и 39 пациентов с нетуберкулёзными заболеваниями мочевой системы.

Продемонстрирована  эффективность ПЦР-анализа при  исследовании костномозговых аспиратов  у больных лихорадкой неясного генеза при подозрении на туберкулёзный  характер заболевания. Для диагностики  туберкулёзного лимфаденита у детей  были изучены 102 пункционных аспирата и биоптата 67 детей с подозрением  на туберкулёзный лимфаденит. Положительные  результаты были получены: методом  ПЦР в реальном времени - 71.6%. флюоресцентной микроскопии - 46,3%. культурального исследования - 41,8%. При исследовании 50 биоптатов  лимфоузлов у пациентов с болезнью «кошачьих царапин» все результаты были отрицательными. Таким образом, была продемонстрирована 100% специфичность  ПЦР-анализа. В этой же работе при  пункционной биопсии лимфоузлов была показана возможность обнаружения  М. avium.

Диагностика туберкулёза  женской половой сферы при  бесплодии, как известно, является одной  из наиболее трудных проблем диагностики. При исследовании с помощью ПЦР  биопсий эндометрия, эндометриальных  аспиратов и образцов жидкости из дугласова пространства у 14 (56%) из 25 пациенток, обследованных лапароскопически с подозрением на туберкулёз, были получены положительные результаты. С помощью микроскопии мазка  и культурального исследования были получены 1 и 2 соответственно положительных  результата. Эти случаи также были ПЦР-положительными. Большинство ПЦР-положительных  результатов относилось к случаям  с характерными признаками туберкулёза  по данным гистологического исследования; меньшее число - при подозрении на туберкулёз по данным лапароскопии. Лишь один положительный результат ПЦР-анализа был получен при отсутствии лапароскопических данных на туберкулёз.

При диагностике  внелёгочных форм туберкулёза у  клиницистов нередко возникает  вопрос о возможности выявления  возбудителя при исследовании методом  ПЦР образцов крови. Литературные данные свидетельствуют, что выявление  ДНК микобактерий туберкулёза из образцов крови возможно при далеко зашедших формах ВИЧ-инфекции. Обнаруживали ДНК микобактерий туберкулёза лишь при генерализованном туберкулёзе  различных органов у пациентов  с трансплантированной почкой и  иммунодепрессией.

Видовая идентификация микобактерий

Метод ПЦР может  быть достаточно эффективен для быстрой  идентификации микобактерий туберкулёзного комплекса и некоторых видов  нетуберкулёзных микобактерий после  получения их первичного роста. В  этом случае использование ПЦР может  экономить 7-10 дней, необходимых для  последующей культуральной идентификации  положительного результата. Исследование методом ПЦР является технически очень простым, поскольку не требует  сложной пробоподготовки клинического материала для достижения высокой  чувствительности. При исследовании 80 положительных в такой тест-системе (MB ВасТ. фирмы Organon) культур все положительные  результаты ПЦР-анализа были строго специфичны и проводились в течение 1 дня. Для идентификации других видов  микобактерий при получении их в  культуре ДНК возбудителя гибридизуется  со специфическими ДНК-зондами, меченными  акридином, и штаммы детектируют  по появлению хемилюминесценции  с помощью хемилюминометра или  на полосках нитроцеллюлозы с визуальной оценкой после гибридизации. С  помощью такого набора идентифицируют ограниченное число видов: комплекс микобактерий туберкулёза. M. avium, M. avium complex, M. kansasii и M. gordonae.

A.Telenti и соавт.  разработали также относительно  простой и недорогой метод  видовой идентификации клинически  важных видов микобактерий на  основе ПЦР и последующей обработки  двумя рестрикционными ферментами (ферменты, обладающие свойствами  рассечь молекулу ДНК в специфических  точках). При этом амплифицируют  фрагмент ДНК. кодирующий белок  теплового шока (65 кДа), после чего  обрабатывают полученный в ПЦР  фрагмент ДНК размером 439 нуклеотидных  пар раздельно двумя ферментами - Bste II и Нае III. Затем анализируют,  используя агарозный гельэлектрофорез, полученные два продукта, определяя  их размеры (число нуклеотидных  пар) с помощью набора стандартных  фрагментов ДНК (молекулярных  ДНК-маркёров) длиной от 100 до 1000 нуклеотидных  пар. В каждом из определённых  видов (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) обнаруживают 2 или 3 фрагмента  ДНК различного размера для  каждого рестрикционного фермента. Комбинация получаемых различного  размера фрагментов ДНК позволяет  дифференцировать эти виды между  собой.

Разрабатывается технология биологических ДНК-микрочипов. которая  поможет идентифицировать более 100 видов микобактерий в одном исследовании.

Видовая идентификация  может быть проведена также с  помощью ПЦР-амплификации вариабельной области 16S rРНК с последующим  секвенированием ампликонов при  сравнении с соответствующей  первичной структурой, что позволяет  идентифицировать более 40 видов микобактерий.

С помощью ПЦР  может быть также проведена видовая  идентификация внутри комплекса  микобактерий туберкулёза, в том  числе дифференцирование M. bovis и M. bovis BCG. Для этого анализируется наличие  или отсутствие некоторых генов  в геномных областях RD1. RD9 и RD10. RD1 отсутствует  в М. bovis BCG, но присутствует в вирулентных  видах, в том числе в M. bovis.

Определение лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с помощью ПЦР

Задачи молекулярно-генетических методов определения лекарственной  чувствительности или устойчивости микобактерий туберкулёза сводятся к выявлению мутаций в определённых нуклеотидных последовательностях  известных генов. Основные методы основаны либо на прямом прочитывании (секвенировании) этих последовательностей после  амплификации, либо на гибридизации биотин-меченых  фрагментов ДНК, амплифицированных  в ходе ПЦР с ДНК-зондами. Оба  варианта предполагают выявление замен  в нуклеотидных последовательностях, которые при использовании ДНК-зондов приводят к отсутствию или неполноценной  гибридизации на нитроцеллюлозной мембране с помощью ферментного конъюгата (стрептавидин-щелочная фосфатаза) - метод LIPA-Rif-TB.

Метод измерения  флюоресценции в локально фиксированных  на микроучастках ДНК-зондах, комплементарных  к известным мутациям в амплифицированных  с помощью ПЦР участках генов, ответственных за лекарственную  чувствительность или устойчивость, получил название метода микробиочипов. Основной алгоритм проведения этого  исследования следующий. После выделения  ДНК из клинического образца или  культуры микобактерий необходимо провести ПЦР для амплификации соответствующих  фрагментов гроВ гена, ответственного за лекарственную чувствительность к рифампицину, или katG и inhA генов, кодирующих белки микобактерий, ответственные  за чувствительность к изониазиду. Результаты ПЦР оценивают с помощью  агарозного гельэлектрофореза, при  котором подтверждают получение  соответствующих фрагментов ДНК  искомой длины. Затем проводят 2-й  раунд ПЦР для введения в ДНК  флюоресцентной метки. Результаты ПЦР  вновь подтверждают при гельэлектрофорезе. После этого проводят гибридизацию (инкубация в течение ночи) с  последующей отмывкой полученного  материала на биочипе, который представляет собой большое число фиксированных  на маленькой стеклянной пластинке  коротких цепей ДНК (зондов), комплементарных  к нуклеотидным последовательностям  чувствительного к лекарствам типа микобактерий туберкулёза в точках возможных мутаций. а также к мутантным последовательностям, ответственным за лекарственную устойчивость. Расположение ДНК-зондов на пластинке - строго определённое, а уровень наблюдаемой флюоресценции при гибридизации для определения результата с помощью специального считывающего устройства установлен. В связи с этим результаты анализа определяются с помощью специальной компьютерной программы.

В последние годы развиваются и альтернативные методы определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулёза на основе технологии ПЦР в реальном времени, позволяющие проводить эти исследования в режиме закрытой пробирки.

На рис. 13-13 представлен  результат анализа клинических  культур микобактерий туберкулёза  при определении лекарственной  устойчивости к рифампицину с  помощью ПЦР в реальном времени: 218 - контрольный образец (чувствительный к рифампицину); 93 - положительный  контроль на мутацию Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - положительный  контроль на мутацию Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - экспериментальные  образцы. Результат расчёта кинетических кривых амплификации по 4 каналам: канал 1: 393 - положительный контроль на мутацию Ser-Trp TCG-TGG; канал 2: 4482 - положительный  контроль на мутацию Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - экспериментальные образцы; канал 4: кинетические кривые амплификации всех образцов, участвующих в эксперименте. Положительный контроль реакции  амплификации. Выводы: по результатам  анализа выявлены следующие мутации, определяющие устойчивость к рифампицину: в образцах 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Этот же принцип использован для определения  лекарственной устойчивости к изониазиду по генам katG и inhA, определяющим наиболее частые мутации.