Анализ крови туберкулезного больного

В связи с тем  что в процессе химиотерапии происходит повреждение различных метаболических систем микробной клетки, часть микобактериальной  популяции утрачивает способность  нормально развиваться на обычных  питательных средах и требует  осмотически сбалансированных (полужидких или жидких) питательных сред.

Оценка  и учет результатов посева диагностического материала

Некоторые штаммы и  виды микобактерий растут медленно, рост может появляться даже к 90-му дню. Число  таких культур невелико, но это  заставляет выдерживать посевы в  термостате в течение 2,5-3 мес.

Вирулентные культуры микобактерий туберкулёза обычно растут на плотных яичных средах в виде R-форм колоний различной величины и вида. Колонии сухие, морщинистые, цвета слоновой кости, слегка пигментированные. На других средах колонии микобактерий туберкулёза могут быть более  влажными. После курса химиотерапии или в процессе лечения могут  выделяться гладкие колонии с  влажным ростом (S-формы).

При выделении культур  используют комплекс специальных исследований, позволяющих отличить микобактерии туберкулёза от нетуберкулёзных  микобактерий и кислотоустойчивых  сапрофитов.

Положительный ответ  дают после обязательного микроскопического  исследования окрашенного по Цилю-Нельсену мазка из выросших колоний. В случае роста микобактерий в мазках обнаруживают ярко-красные палочки, лежащие одиночно или группами, образующие скопления  в виде войлока или кос. В молодых  культурах, особенно выделенных от длительно  леченных химиопрепаратами больных, микобактерии отличаются выраженным полиморфизмом, вплоть до наличия наряду с палочковидными формами коротких, почти кокковидных  или же удлинённых вариантов, напоминающих мицелий грибов.

Интенсивность роста  микобактерий обозначают по следующей  схеме: (+) - 1-20 КОЕ в пробирке (скудное  бактериовыделение); (++) - 20-100 КОЕ в  пробирке (умеренное бактериовыделение); (+++) - >100 КОЕ в пробирке (обильное бактериовыделение). При лабораторной диагностике туберкулёза недостаточно дать ответ, ющий, обнаружены ли или  нет тем или иным методом микобактерии. иметь детальное представление  об объёме и характере микобактериальной  популяции, её составе и свойствах. Именно эти данные позволяют правильно  интерпретировать состояние процесса, планировать тактику и своевременно корригировать лечение.

В последние годы для ускорения роста микобактерий предложены питательные среды на агаровой основе с различными ростовыми  добавками и применением специальной  газовой смеси. Для получения  роста микобактерий на этих средах при культивировании создают  атмосферу с повышенным содержанием  углекислого газа (4-7%). С этой целью  используют специальные СО₂-инкубаторы. Однако наибольшее развитие получили автоматизированные системы культивирования микобактерий: MGIT-BACTEC-960 и MB/Bact.

Одна из таких  систем - система MGIT (mycobacteria growth indicating tube), которая относится к разработкам  высоких технологий и предназначена  для ускоренной бактериологической диагностики туберкулёза и определения  чувствительности микобактерий к препаратам первого ряда и некоторым препаратам второго ряда. MGIT ориентирована на использование её в составе прибора  ВАСТЕС-960. Культивируют микроорганизмы в специальных пробирках с  жидкой питательной средой на основе модифицированной среды Middlebrook-7Н9. Для  стимуляции роста микобактерий и  подавления роста посторонней микрофлоры используются добавки роста MGIT Growth Supplement и смесь антибактериальных  препаратов PANTA.

Регистрацию роста  микроорганизмов осуществляют оптически. В её основе лежит флюоресценция, возникающая при потреблении  кислорода микобактерия-ми в процессе роста. Кислородзависимый флюорохромный  краситель содержится на дне специальной  пробирки и покрыт слоем силикона. Размножение микобактерий приводит к уменьшению количества кислорода  в пробирке и снижению его концентрации, что вызывает усиление флюоресценции, которая становится видимой при  облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор ВАСТЕС-960. Интенсивность свечения регистрируют в единицах роста (GU- growth units). Данные роста заносятся в компьютер, где их можно сохранить, автоматически. Компьютерный анализ кривых роста может  дать информацию о наличии различных  пулов микобактерий, в том числе  нетуберкулёзных, а также помогает оценить ростовые свойства микобактерий.

В результате внедрения  таких систем время появления  роста микобактерий значительно  сократилось, составляя в среднем 11 дней на ВАСТЕС-960 и 19 дней на MB/Bact против 33 дней на стандартной плотной питательной  среде. Необходимо отметить, что эти  системы требуют высокой квалификации персонала. Посев материала на жидкие среды обязательно сопровождают посевом на среду Левенштейна-Йенсена, играющую роль дублёра в тех случаях, когда на других средах микобактерии туберкулёза не дают роста.

Определение лекарственной чувствительности микобактерий

Определение спектра  и степени чувствительности микобактерий к противотуберкулёзным препаратам имеет важное клиническое значение, а также для эпидемиологической оценки распространения туберкулёза  с лекарственной устойчивостью. Кроме того, мониторинг лекарственной  устойчивости позволяет оценивать  эффективность противотуберкулёзной программы в целом, являясь интегральным показателем работы всех составляющих противотуберкулёзных мероприятий.

Кратность и сроки  определения лекарственной чувствительности:

• до начала лечения однократно для определения стратегии и тактики лечения:
• при изоляции от больного культур из различного материала (мокрота, БАЛ, моча, экссудаты, ликвор и др.) исследуются все выделенные штаммы:
• в конце интенсивной фазы лечения при отсутствии клинико-рентгенологической динамики:
• при необходимости изменения схемы лечения в случае:
• отсутствия негативации мокроты;
• повторного выделения культуры после негативации мокроты;
• резкого увеличения количества КУМ в мазке после первоначального снижения. Хорошо известно, что из материала от больного туберкулёзом выделяют неоднородные по лекарственной чувствительности штаммы микобактерий туберкулёза. Чувствительность штаммов к противотуберкулёзным препаратам может отличаться по спектру препаратов, степени, частоте и скорости появления устойчивости.

Степень лекарственной  устойчивости микобактерий туберкулёза  определяют в соответствии с установленными критериями, которые ориентированы  на клиническую значимость устойчивости и зависят от противотуберкулёзной активности препарата, его фармакокинетики, концентрации в очаге поражения. величины максимальной терапевтической  дозы и прочее.

Определение лекарственной  чувствительности микобактерий в настоящее  время проводят микробиологическими  методами:

• абсолютных концентраций (метод разведений на плотной или жидкой питательных средах),
• пропорций,
• коэффициента резистентности.

Обычно устойчивость проявляется в виде визуально  наблюдаемого роста колоний микобактерий туберкулёза, однако существуют методики, индуцирующие рост в ранних стадиях  деления клеток микобактерий в виде цветных реакций. Эти методы сокращают  время проведения теста с 3-4 до 2 нед.

В качестве унифицированного в России получил распространение  рекомендованный Комитетом по химиотерапии ВОЗ метод абсолютных концентраций, который с методической точки  зрения является самым простым, однако требует высокой стандартизации и точности выполнения лабораторных процедур. Тест на лекарственную чувствительность состоит из набора пробирок с питательной  средой, модифицированной противотуберкулёзными  препаратами. Набор состоит из 2-3 пробирок с разными концентрациями каждого из используемых препаратов, одной контрольной пробирки со средой без препарата и одной пробирки, содержащей 1000 мкг/мл сали-циловокислого  натрия или 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты для выявления роста  нетуберкулёзных микобактерий.

Для приготовления  набора сред с препаратами используют модифицированную среду Левенштейна-Йенсена (без крахмала), которую разливают  в колбы. В каждую из колб добавляют  определённый объём соответствующего разведения противотуберкулёзного  препарата. Содержимое колб тщательно  перемешивают, разливают в пробирки и свёртывают в наклонном положении  в течение 40 мин при температуре 85 °С. Свёртывание среды рекомендуют производить в электросвёртывателе с автоматической регулировкой температуры. Среда с противотуберкулёзными препаратами

1-го ряда может  храниться в холодильнике при  2-4 °С в течение 1 мес, с препаратами  2-го ряда - не более 2 нед. Хранение  сред с препаратами при комнатной  температуре недопустимо. При  приготовлении растворов противотуберкулёзных  препаратов учитывают их активность, рассчитывая концентрацию с поправкой  на молекулярную массу неспецифической  части препарата, чистоту и  т.д. Для определения лекарственной  чувствительности используют только  химически чистые субстанции.

Принцип метода состоит  в определении концентрации противотуберкулёзного  препарата, подавляющей рост значительной части популяции микобактерий. При  правильном выполнении этот метод имеет  хорошую достоверность.

Перед постановкой  теста необходимо убедиться, что  выделенная культура микобактерий туберкулёза  не имеет посторонней микрофлоры. Из культуры микобактерий в 0,9% растворе натрия хлорида готовят гомогенную взвесь, содержащую 500 млн микробных  тел в 1 мл (оптический стандарт мутности 5 единиц). Полученную взвесь разводят 0,9% раствором натрия хлорида (1:10) и  вносят по 0,2 мл взвеси в каждую пробирку набора питательных сред. Засеянные  пробирки помещают в термостат при 37 °С и выдерживают в горизонтальном положении в течение 2-3 сут, чтобы  скошенная поверхность питательной  среды была равномерно инокулирована  взвесью микобактерий туберкулёза. Затем пробирки переводят в вертикальное положение и инкубируют в течение 3-4 нед. Учёт результатов проводят через 3-4 нед.

Поскольку сроки  выделения возбудителя из клинического материала на питательных средах составляют не менее 1-1,5 мес, результаты определения лекарственной чувствительности указанным методом можно получить не ранее чем через 2-2,5 мес после  посева материала. В этом заключается  один из основных недостатков метода.

Интерпретируют  результаты определения лекарственной  чувствительности микобактерий на основе определённых критериев. На плотных  средах культура считается чувствительной к той концентрации препарата, которая  содержится в среде, если число колоний  микобактерий, выросших на данной пробирке с препаратом, не превышает 20 при  обильном росте на контрольной пробирке без препаратов. Только при наличии  более 20 колоний культура расценивается  как устойчивая к данной концентрации. На практике при получении результатов  роста в опытных пробирках, близких  к 20 КОЕ. необходимо известить клиническое  подразделение, что чувствительность или устойчивость в этом случае носит  пограничный характер, так как  иногда это может объяснить нечёткую динамику клинических показателей.

Для различных препаратов установлена определённая концентрация, при которой наблюдают размножение  критической доли микобактериальной  популяции. Эти концентрации носят  название «критические». В качестве критерия устойчивости используют величину роста популяции микобактерий на питательной среде с препаратом в критической концентрации.

В отечественной  фтизиатрической практике при определении  лекарственной устойчивости не ограничиваются определением только критических концентраций. Это связано с тем. что расширенное  определение уровня лекарственной  устойчивости возбудителя позволяет  клиницисту более правильно сформировать тактику химиотерапии, используя  знания о потенцирующем действии комбинаций лекарственных препаратов, предвидеть перекрёстную устойчивость или применить более эффективные  препараты используемой группы противотуберкулёзных препаратов.

Метод абсолютных концентраций наиболее прост, однако и наиболее чувствителен к допускаемым ошибкам при  его выполнении. Более достоверным, особенно при определении чувствительности к препаратам 2-го ряда, и распространённым вне России является метод пропорций. В нём учтены недостатки метода абсолютных концентраций, однако в исполнении он более трудоёмок.

Метод очень похож  на метод абсолютных концентраций. Приготовление тестовых пробирок с  лекарственными препаратами производят так же. как при методе абсолютных концентраций. Однако посевная доза суспензии  микобактерий туберкулёза снижена  в 10 раз. что нивелирует частоту спонтанной устойчивости некоторых штаммов  микобактерий туберкулёза к таким  препаратам, как Этамбутол, протионамид, капреомицин. В качестве контрольных  используют 2 или 3 пробирки с посевной дозой, равной в тестируемых пробирках, последовательно разведённых в 10 и 100 раз. Критерием устойчивости служит доля визуально наблюдаемого роста  микобактерий туберкулёза. Для препаратов 1-го ряда критерием устойчивости служит превышение роста 1% от исходной популяции, для препаратов 2-го ряда - рост 1 или  более 10% от исходной, в зависимости  от выбранной критической концентрации.

В 1997 г. рабочая группа ВОЗ и Международного противотуберкулёзного  союза по выявлению противотуберкулёзной лекарственной устойчивости внесла коррективы в эти критерии, предложив  считать устойчивыми микобактерии, вырастающие на плотной яичной среде  Левенштейна-Йенсена при следующих  концентрациях:

• дигидрострептомицин - 4 мкг/мл;
• изониазид - 0,2 мкг/мл:
• рифампицин - 40 мкг/мл:
• Этамбутол - 2 мкг/мл.