Гели для электрофореза

                    

Введение  мочевины и b-меркаптоэтанола. 
Некоторые артефакты

Высокая концентрация белков в зонах может привести к их 
осаждению или, по крайней мере, образованию агрегатов: ди- 
мерных, тримерных и более крупных белковых комплексов, ко- 
торые могут давать дополнительные полосы. Агрегация проис- 
ходит, в основном, за счет водородных связей. Для ее предотвра- 
щения в рабочий буфер нередко добавляют мочевину в концент- 
рации 4 — 8 М. Она должна быть хорошо очищена, в частности 
деионизована. Кроме того, следует всегда иметь в виду возмож- 
ность частичного разложения мочевины с образованием циано- 
вой кислоты и карбамоилирования белков. Это особенно отно- 
сится к долго хранящимся буферам, поэтому лучше добавлять 
сухую мочевину в буфер непосредственно перед приготовлением 
геля. Если все же возникает подозрение, что некая полоса появи- 
лась за счет карбамоилирования, то следует добавить в исход- 
ный препарат цианат и посмотреть, не усилится ли подозритель- 
ная полоса. Для предварительной деионизации маточный рас- 
твор мочевины (10 М) суспендируют с бифункциональной ионо- 
обменной смолой (например, AG 501 ´ 8) в соотношении 5 г 
смолы на 100 мл раствора в течение часа при комнатной темпе- 
ратуре.

b-Меркаптоэтанол в концентрации 1 — 5% нередко вносят в 
исходный белковый препарат для предохранения его от окисле- 
ния и образования лишних дисульфидных мостиков. Более энер- 
гичное воздействие с разрывом нативных дисульфидных связей 
и разделением белковых субъединиц производят путем нагрева- 
ния белкового раствора до 90 — 100° в присутствии не только b- 
меркаптоэтанола или его аналогов, но н ДДС-Na.

В некоторых случаях при использовании  боратного буфера 
или буферов, содержащих аминокислоты (глицин, аланин), воз- 
можно образование комплексов компонентов буфера с белками. 
Их электрофоретическая подвижность может оказаться несколь- 
ко иной, чем у чистых белков, и соответствующие белковые по- 
лосы раздвоятся. Проверить такого рода артефакт можно по- 
вторным электрофорезом. В силу равновесного характера про- 
цесса образования комплексов каждая из двух полос дублета 
при ее повторном электрофорезе в том же буфере даст снова две 
полосы.

 В главе 1 уже упоминалось  об опасности, которую представ- 
ляют для белков сохраняющиеся в геле после полимеризации 
долгоживущие свободные радикалы. Указывалось также на спо- 
соб их удаления — «преэлектрофорез», т. е. пропускание тока 
через гель без внесения препарата. Добавим, что в особых слу- 
чаях для полной очистки от радикалов во время преэлектрофо- 
реза через гель пропускают такие связывающие их соединения, 
как цистеин, меркаптоуксусная (тиогликолевая) кислота или 
гидрохинон. При фракционировании очень малых количеств белка может 
оказаться заметной сорбция их на геле (белки «размазывают- 
ся» по гелю). Блокировать это явление можно, вводя в исход- 
ный препарат дополнительный быстро мигрирующий белок. Про- 
ходя через гель впереди всех остальных белков препарата, он 
насыщает собой центры неспецифической сорбции в геле.

Лидирующие красители

Для наблюдения за ходом электрофореза  в исходный препа- 
рат вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что 
и фракционируемые белки. Он не должен заметным образом свя- 
зываться с белками, а скорость его продвижения по гелю долж- 
на быть заведомо больше, чем у наиболее быстро мигрирующего 
белка. Вместе с тем краситель не должен слишком сильно от- 
рываться от белков, чтобы его прохождению до конца пласти- 
ны или трубки соответствовало использование большей части 
находящегося в них геля для фракционирования белков. Быть 
может, по ассоциации с велосипедными гонками за лидером, этот 
краситель называют лидирующим («tracker dye»).

В щелочных и нейтральных буферах, когда кислые белки за- 
ряжены отрицательно и мигрируют к аноду, а также для любых 
белков в комплексе с ДДС-Na (см. ниже) используют отрица- 
тельно заряженные красители. Наибольшее распространение по- 
лучил бромфеноловый синий, имеющий достаточно сложную 
структуру; в его состав, в частности, входят два дибромфеноль- 
ных остатка. Иногда используют еще более сложно построен- 
ный краситель — ксиленцианол, электрофоретическая подвиж- 
ность которого примерно вдвое ниже, чем бромфенолового сине- 
го, поэтому его используют при фракционировании крупных бел- 
ков и нуклеиновых кислот.

Для характеристики электрофоретической подвижности  бел- 
ка в данных условиях электрофореза принято указывать отно- 
шение расстояния, пройденного белковой полосой от начала ра- 
бочего геля, к аналогичному расстоянию до полосы красителя 
в этом же геле. Это отношение, как и в хроматографии, обозна- 
чают R_f.

В качестве положительно заряженного красителя для электрофореза в кислой среде, когда белки мигрируют в направлении 
катода, используют метиловый зеленый или пиронин.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Литература:

 

·  Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.

·  Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М., МЦНМО, 2002, 248 с.

·  Д. Кларк, Л. Рассел Молекулярная биология: простой и занимательный подход. Глава 16 (Методы молекулярной биологии)