Электрофорез ДНК

Биологиялық полимерлер, немесе макромолекулалар, молекулалары көп мәрте қайталанып отыратын буындардан — мономерлерден -құралған жоғары молекулалы (молекулалық массасы 103-109 даль-тон) органикалық қосылыстар болып табылады. Биополимерлерге белоктар, нуклеин қышқылдары, көмірсулар мен олардың туыңдылары — крахмал, гликоген, целлюлоза, гемицеллюлоза, пектинді заттар, хитин т.б. – жатады. Тиісінше амин қышқылдары, нуклеотидтер және моносахаридтер олардың мономерлері болып табылады.    Жасушалар құрғақ затының 90 пайызға жуығы макромолекулалардан құралады. Жануарлар жасушаларында белоктар, ал өсімдік жасушаларында — полисахаридтер басым болады. Шамамен бактериялар құрамында 3 мыңға жуық белок, 1 мыңға жуық нуклеин қышқылдары болса, адамда белоктар саны 5 млн. жетеді. Олардың барлығы тірі организмдердің құрылымдық негізі болады да, тіршілік әрекеттерін қамтамасыз етуде маңызды қызмет атқарады.  Биополимерлер пішіні жағынан сызықты (белоктар, нуклеин қышқылдары, целлюлоза) немесе тармақты (гликоген) тізбек болып табылады. Осымен байланысты олар тамаша қасиеттерге ие болады. Біріншіден, олардың өзара әсері барлық функционалдық топтарының бір-бірімен тығыз байланысуымен — кооперативтігімен, -ерекшеленеді. Осынан полимердің бір тобының өзара әсерінен оның басқа топтарының өзара әсерлесу сипаты өзгереді. Оған мысал ретіңде гемоглобин белогының оттегі молекуласын байланыстыруын келтіруге болады. Екіншіден, биополимерлер ішкі полимерлік кешендер (комплекстер) құрай алады. Олар молекуланың әр түрлі бөліктері немесе әр түрлі молекулалар арасында пайда болуы мүмкін. Осындай кешендердің пайда болуының және биополимерлердің басқа да қасиеттерінің арқасында белоктар мен нуклеин қышқылдары биосинтезі, зат алмасу процесінің реттелуі, иммундық реакциялар және басқа да маңызды биологиялық процестер атқарылады.

ДНК молекуласы бір-біріне спираль (шиыршық) түрінде орала орналасқан қосаоланған тізбек нуклеотидтерден түзіледі. Нуклеин қышқылдары молекулалары құрамында нуклеотидтер саны әртүрлі. Тасымалдаушы РНК молекуласында олардың саны 80-ге жуық болса, ДНК молекуласында ондаған мыңға жетеді. ДНК-ның кез келген нуклеотидінің құрамына аденин, гуанин, тимин, цитозин азотты негіздерінің бірі, дезоксирибоза және фосфор қышқылының қалдығы енеді. РНК-ның нуклеотидтерінің кұрамына азотты негіздер — аденин, гуанин, урацил, цитозиннің бірі, рибоза және фосфор қышқылының қалдығы енеді. Демек, нуклеотидтер тек азотты негіз сипатымен өзгешеленеді. Цитозин, тимин, уроцил — пиримидин негіздеріне, ал аденин мен гуанин — пурин негіздеріне жатады.

Электрофорез (от электро- и др.-греч. φορέω — «переношу») — это электро­кине­ти­чес­кое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.  С помощью электрофореза удаётся покрывать мелкими частицами поверхность, обеспечивая глубокое проникновение в углубления и поры. Различают две разновидности электрофореза: катафорез — когда обрабатываемая поверхность имеет отрицательный электрический заряд (то есть подключена к отрицательному контакту источника тока, являясь катодом) и анафорез — когда заряд поверхности положительный.   Электрофорез применяют в физиотерапии, для окраски автомобилей, в химической промышленности, для осаждения дымов и туманов, для изучения состава растворов и др. Электрофорез является одним из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии.

        Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.  К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель (например, динитрофенол, бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.  Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис и борную кислоту: TAE и TBE. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля.  После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.   Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, «линейка»), содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины.    Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.

           Электрофорез белков — способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки. Электрофорез белков применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для получения гомогенного белка. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков, является электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли.

Существует множество  разновидностей и модификаций данного  метода, которые используются (или  использовались в определённые периоды  развития биохимии) в различных областях:[2]

Электрофорез в свободных  средах (без поддерживающей среды)

Электрофорез с подвижной  границей

Зональный электрофорез без  поддерживающей среды

Капиллярный электрофорез

Зональный электрофорез в  поддерживающей среде с капиллярной  структурой

Электрофорез на фильтровальной бумаге

Электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране

Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды

Электрофорез белков в  ПААГ

Электрофроез белков в крахмальном геле

Электрофорез белков в  агарозном геле

Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный (2D-) электрофорез, препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков и электрофорез в присутствии детергента (в денатурирующих условиях). Разновидностью метода электрофореза являются изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез. В случае использования иммунологических методов для выявления разделённых белков говорят про иммуноэлектрофорез.    Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов). Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике.  Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (англ. SDS PAGE).

Тоғыспалы иммуно-электрофорез (ТИЭФ) —вирустар және бактериялар тудырған ауруларға иммунологиялық диагноз қою әдістерінің бірі. Бір-біріне сай антиген мен антиденелердің гелді ортада преципат жасауына негізделген. Әдетте қолданылып жүрген иммунодифузия әдістері антидене мен антигеннің кеңістікте барлық бағытта бос жылжуын пайдаланады, ал ТИЭФ-де олар электр күшінің әсерімен кездескенге дейін бір-біріне қарсы жылжиды. Көпшілік антигендерде сілтілік қасиет бар, сондықтан олар анодқа қарай жылжиды, ал антиденелер нейтральды болады да, гель сұйықтығымен қосылып, электроосмостың әсерінен катодқа қарай жылжиды.