Гели для электрофореза

Содержание

Введение…………………………………………………………  2

Гели  для электрофореза………………………………….6

Электрофорез  белков ……………………………………17

Литература…………………………………………………….29

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Электрофорез занимает сейчас центральное место среди методов исследования белков. В современной научной литературе редко можно встретить статью, в которой 
бы на той или иной стадии фракционирования или характеристики этих биополимеров не был использован электрофорез. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная 
масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

Физический принцип метода заключается в следующем. На- 
ходящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают неко- 
торым суммарным электрическим зарядом, величина и знак ко- 
торого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключен- 
ный в канал из изолирующего материала, например стеклянную 
трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала 
установится определенный градиент напряжения, т. е. сформи- 
руется электрическое поле. Его напряженность измеряется раз- 
ностью потенциалов по концам рабочего канала (или его уча- 
стка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля мак- 
ромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом миг- 
рируют в направлении катода или анода, причем их трение об 
окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависи- 
мости от величины заряда и размеров молекулы приобретают 
разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза. 
Постепенно исходный препарат, состоявший из различных моле- 
кул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с 
одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределя- 
ются по длине канала (рис. 1, справа).

На рисунке, помимо рабочего канала (трубки), показаны не- 
которые необходимые компоненты системы. Во-первых, это два 
электрода, представленные спиральками из платиновой прово- 
локи, а во-вторых, электродные резервуары. Через находящиеся 
в них буферные растворы и рабочий канал замыкается электри- 
ческая цепь между электродами.

Рабочий канал не случайно заштрихован. Дело не только в 
том, что, будь он просто заполнен жидкостью, изображенная 

Схема выглядела бы нелепо, так как буфер из трубки и верхнего 
резервуара должен был вылиться в нижний. Эту трудность мож- 
но обойти, если придать каналу с жидкостью U-образную фор- 
му. Такие приборы использовались на первых этапах развития 
метода (электрофорез в свободной жидкости). Хуже другое: в 
жидкости нельзя избежать конвекции, которая деформирует и 
смешивает разделяющиеся зоны. Поэтому в современных при- 
борах рабочий канал заполняют гелем, что на схеме изобра- 
жено штриховкой. Достаточно чи- 
стая и хорошо смачиваемая (гид- 
рофильная)    пространственная 
сетка геля удерживает жидкость 
от вытекания и препятствует кон- 
векции. Вместе с тем используе- 
мые гели содержат очень много 
жидкости (80—99,5%), в которой 
(т. е. в рабочем буфере) и мигри- 
руют макромолекулы. Наличие 
сетки геля вносит важную допол- 
нительную деталь в картину элек- 
трофоретической миграции. Те- 
перь фракционируемые макромо- 
лекулы любых размеров неизбеж- 
но сталкиваются с нитями поли- 
мера, образующего сетку геля, 
что увеличивает эффективное 
трение о среду, а следовательно, 
снижает скорость движения мо- 
лекул. Очевидно, что препятствия 
для миграции становятся особен- 
но серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек 
геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом 
случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность 
различных макромолекул и степень разделения оказывает соот- 
ношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, 
когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кис- 
лот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их 
миграция прекратится.

Рис. 1. Схема простейшего прибо- 
ра для электрофореза в геле

а — до начала фракционирования, б — 
после его окончания

В настоящее время почти исключительно  используются по- 
лиакриламидные гели (ПААГ). Варьируя кон- 
центрацию полимера, можно получать гели с очень широким 
диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электри- 
ческие заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их 
конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих аген- 
тов или детергентов. Все это придает методу электрофореза ис- 
ключительную гибкость.

Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макро- 
молекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их 
диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серьезно, что протекание через жидкость электрического тока неиз- 
бежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные моле- 
кулы белков и нуклеиновых кислот диффундируют не слишком 
быстро. Однако проблема теплоотвода и, главное, его равномер- 
ности по всему гелю очень важна еще и потому, что скорость 
миграции макромолекул в электрическом поле зависит от тем- 
пературы. Неравномерность нагревания геля неизбежно приве- 
дет к искажению зон и ухудшению их разделения.

В ходе электрофореза зоны растворенных макромолекул ос- 
таются невидимыми. Для наблюдения за процессом в исходный 
препарат добавляют краситель, молекулы которого несут элек- 
трический заряд того же знака, что и фракционируемые макро- 
молекулы, но не взаимодействуют с ними. Краситель тоже пере- 
двигается в электрическом поле, но уже в виде окрашенной зо- 
ны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость миграции 
наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем 
у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца 
трубки, электрофорез прекращают.

Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффу- 
зии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стек- 
лянной формы и вымачивают в смеси кислоты со спиртом так, 
что белки или нуклеиновые кислоты выпадают в осадок в том 
самом месте, где закончилась их миграция в ходе электрофоре- 
за. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окраши- 
вание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно 
связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек 
красителя удаляют. На фотографии окрашенного цилиндриче- 
ского ПААГ (рис. 2) хорошо видны четкие, узкие полосы раз- 
делившихся компонентов исходной смеси белков.

Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких 
пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. 
Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно 
одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно 
их вносят с одного края геля на равных расстояниях друг от 
друга. Каждый препарат разделяется в электрическом поле не- 
зависимо от своих соседей, образуя свой набор зон. На фото- 
графии такой пластины (рис. 3) хорошо видна серия параллель- 
ных «треков», исчерченных поперечными полосами окрашенных 
зон, в которых располагаются (в данном случае) олигонуклео- 
тиды различной длины.

Вместо окрашивания или наряду с ним часто используют ме- 
тоды обнаружения разделенных зон по их радиоактивности. 
К ним относятся приемы регистрации полос на фотопленке по- 
средством авторадиографии или флюорографии и различные 
способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных 
сцинтилляционных счетчиков.

Преимущества пластин  не ограничиваются экономией вре- 
мени и места при обработке большого количества препаратов. 
Важнее другое: поскольку гель заливают в форму для полиме- 

ризации жидким, то его концентрация, состав буфера и содер- 
жание добавок строго одинаковы по всему сечению геля. Следо- 
вательно, плотность тока и напряженность электрического поля 
также одинаковы. Это обеспечивает строго идентичные условия 
фракционирования разных препаратов и дает возможность до- 
стоверного сопоставления их состава путем сравнения положе- 
ния полос в параллельных треках. Если добавить к этому зна- 
чительно более выгодные условия теплоотвода от тонкой пла- 
стинки геля по сравнению с цилиндром, то станет понятной ис- 
ключительная популярность этой системы электрофореза в по- 
следние годы.

Фракционированием в ПААГ  не исчерпываются 
современные методы электрофореза. В качестве «носителей» 
жидкой фазы широко используют также пленки из ацетата цел- 
люлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, цел- 
люлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для 
разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют 
свои преимущества, однако для фракционирования белков, ну- 
клеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время исполь- 
зуют почти исключительно гель-электрофорез, поэтому только 
он и будет подробно описан.

Рассмотрение начинается с характеристики исходных мате- 
риалов и процессов их полимеризации. Затем, чтобы освобо- 
дить дальнейшее изложение от повторений, будет описана тех- 
ника приготовления гелей и соответствующая аппаратура.  
После замечаний общего характера будут подробно рассмотрены различные современные 
приемы и варианты электрофореза. В отдельные разделы выне- 
сены способы окрашивания, элюции из геля и регистрации ра- 
диоактивности фракционированных белков, поскольку эти при- 
емы в большинстве своем одинаковы для всех вариантов элек- 
трофореза. Замечания общего характера, изложенные в предыдущей главе, во многом относятся к фракционированию обоих типов биополимеров, поэтому здесь будут рассмотрены только специфические особенности электрофореза нуклеиновых кислот. В обеих последних главах для иллюстрации различных экспериментальных приемов электрофоретического разделения биополимеров разбираются многие новейшие работы. Разумеется, при этом приводятся только наиболее существенные данные. Более детальное описание следует искать в оригинальных публикациях, 
на которые будут даны ссылки. 

Рис. 2. Трубки с ПААГ после окончания электрофореза

Горизонтальные полоски — окрашенные белковые зоны

Рис. 3. Пластина агарозного геля после разделения фрагментов ДНК

Окраска люминесцентным красителем (бромистым  этидием)

 

Гели  для электрофореза

ПОЛИАКРИЛАМИДНЫИ  ГЕЛЬ (ПААГ)

Исходные материалы

Акриламид (СН₂= СН — CONH₂) представляет собой белый 
кристаллический порошок. Хорошо очищенный продажный пре- 
парат содержит не более 0,05% акриловой кислоты. Его 5%-ный 
водный раствор должен иметь рН не ниже 5, а оптическая плот- 
ность 1%-ного раствора при 290 нм (А₂₉₀) не должна превышать 
0,15. Такой препарат можно использовать без дополнительной 
очистки или перекристаллизации. Акриламид следует хранить 
сухим, в темной посуде, предпочтительно на холоду. В этих ус- 
ловиях он может храниться до года. Акриламид токсичен (воз- 
действует на кожу и нервную систему), поэтому отвешивать и 
растворять его следует в перчатках и под тягой.

Недостаточно чистый препарат можно  перекристаллизовать. 
Для этого 70 г акриламида растворяют в 1 л хлороформа при 
50°, фильтруют при этой же температуре, затем охлаждают до 
— 20°, быстро промывают кристаллы холодным хлороформом и 
высушивают в вакуум-эксикаторе. Для освобождения от УФ-по- 
глощающих примесей акриламид можно обработать активиро- 
ванным углем. Для этого в маточный 30 — 40%-ный водный рас- 
твор акриламида в смеси с метиленбисакриламидом добавляют 
 

активированный  уголь (примерно 50 г/л), суспензию перемеши- 
вают в течение 30 мин и фильтруют сначала через бумажный, а 
затем через стекловолокнистый фильтр.

NN'-Метиленбисакриламид («Бис»)  – (CH₂= CH — CONH)₂– 
СН₂ — используют в качестве «сшивки» линейных полимеров ак- 
риламида. Продажные препараты, содержащие не более 0,02% 
акриловой кислоты, не нуждаются в дополнительной очистке. 
В случае необходимости Бис можно перекристаллизовать из 
ацетона (12 г/л) в тех же условиях, что и акриламид. Условия 
хранения и токсичность — такие же, как у акриламида.

В качестве «сшивки» иногда используют этилендиакрилат — 
СН₂= СН — СО — O — СН₂— СН₂— О — СО — СН = СН₂, а также 
NN'-диаллилтартардиамид   (ДАТД) — CH₂= CH — CH₂— NH — 
CO — CH(OH) — CH(OH) — CO — NH — CH₂— CH = CH₂. С их по- 
мощью получают «растворимые» гели. В первом случае эфирную 
связь можно разорвать обработкой геля щелочью или водным 
раствором пиперидина. Гели, сшитые ДАТД, растворяются за 
20 — 30 мин при комнатной температуре в 2%-ной йодной кисло- 
те. Использование растворимых гелей на основе акриламида 
будет рассмотрено ниже.

Персульфат аммония производится в виде белого кристалли- 
ческого порошка или гранул. Его используют в качестве инициа- 
тора процесса полимеризации. Гомолитический разрыв связи 
между атомами кислорода в молекуле персульфата аммония

приводит к образованию двух достаточно долго живущих сво- 
бодных радикалов с одним неспаренным электроном у атома 
кислорода:

Такой радикал стимулирует разрыв двойной  связи в молекуле 
акриламида и присоединяется к ней таким образом, что снова 
образуется радикал с неспаренным электроном, но уже у атома 
углерода:

Этот радикал, в свою очередь, вызывает разрыв двойной связи 
и присоединение следующей молекулы акриламида с образова- 

 

нием  нового радикала и т. д. Цепная реакция  полимеризации 
идет до тех пор, пока два радикала, встретившись между собой, 
не образуют обычную ковалентную связь. По тому же механизму 
в растущую цепочку линейного полимера может одной из своих 
концевых винильных групп встроиться и метиленбисакриламид. 
Второй его конец может точно так же оказаться в составе дру- 
гой линейной полимерной цепочки, и образуется «сшивка».