Гели для электрофореза

Возвращаясь к ПААГ, следует указать, что гели с очень вы- 
соким содержанием метиленбисакриламида (С > 15) хрупки, 
легко отстают от стенок, непрозрачны и сильно окрашиваются. 
Этих недостатков лишены гели, сшитые NN^/-диaллилтapтapдиa- 
мидом. Например, гель с T = 5 и С = 15, сшитый ДАТД, оказы- 
вается настолько крупнопористым, что не тормозит миграцию 
биополимеров с молекулярной массой 0,5 млн. дальтон; при 
этом он механически прочен, хорошо сцепляется со стеклом и 
прозрачен [Baumann, Chrambach, 1976]. Вспомним, что такой 
гель к тому же растворим в йодной кислоте. Недавно описано 
успешное использование для электрофореза белков еще сильнее 
сшитого геля этого типа. В нем величина С достигала 27, т. е. 
отношение акриламид/ДАТД не превышало 4 : 1 [Spath, Koblet, 
1979].

Рассмотрим теперь подробнее влияние  выбора значений Т и 
С для обычного ПААГ на скорость миграции в нем биополиме- 
ров. Тормозящий эффект трения о гель проявляется в снижении 
электрофоретической подвижности заряженных макромолекул в 
геле (и') по сравнению с их подвижностью в свободной жидкости с такими же, как у буфера геля, значениями рН и ионной си- 
лы раствора (u₀). Электрофоретическую подвижность определя- 
ют как величину скорости миграции заряженных молекул (см/ч) 
при напряженности поля 1 В/см. Величина и₀ зависит от соотно- 
шения суммарного электрического заряда макромолекулы (при 
данном рН) и ее массы. Сила, действующая на молекулу в элек- 
трическом поле, пропорциональна заряду, а противодействую- 
щая миграции вдоль силовых линий поля сила трения о жид- 
кость пропорциональна линейному размеру молекулы, а следо- 
вательно, кубическому корню из ее массы. Для ориентировки 
заметим, что электрофоретическая подвижность большинства 
кислых белков в свободной жидкости при рН 8,8 лежит в пре- 
делах 0,1 — 0,5 см/ч на 1 В/см. Прямой корреляции между мас- 
сой молекулы и величиной и₀, очевидно, быть не должно 

В геле трение существенно возрастает, причем тем сильнее, 
чем больше масса молекул и меньше средний размер пор, т. е. 
чем больше величина Т (для малых значений С). Показано, что 
имеет место соотношение: ln(и'/и₀) = — k_RT. Величина коэффи- 
циента торможения k_R (порядка 0,1— 0,4) зависит от среднего 
радиуса молекулы R и степени сшивки геля С, слабо увеличи- 
ваясь с ростом последней в пределах от 1 до 7. Для глобуляр- 
ных белков R лежит в диапазоне от 1,57 нм для лактальбумина 
(M = 12400) до 3,61 нм для церулоплазмина (M = 151 000).

Для эффективного разделения белков при электрофорезе в 
ПААГ соотношение u'/u₀ должно составлять 0,1 — 0,2. Отсюда 
следует, что оптимальная электрофоретическая подвижность 
белков в ПААГ лежит в пределах 0,01— 0,1 см/ч на 1 В/см. При 
напряженности поля 10  —  20 В/см этому соответствуют скорости 
миграции белков в диапазоне 0,1 — 2 см/ч. Таким образом, при 
рабочей длине геля 10 см за 5 ч электрофореза наиболее быст- 
рые белки могут достигнуть конца геля, в то время как наименее 
подвижные продвинутся лишь на 0,5 см. Цифры эти — сугубо 
приближенные и приведены здесь лишь для общей ориентиров- 
ки. В конкретных случаях возможны существенные отклонения 
от них. Например, если заранее известно, что разделяемые бел- 
ки сильно различаются между собой по заряду или размерам, то 
можно вести электрофорез в условиях более высоких подвижно- 
стей (и'), т. е. в более крупнопористых гелях, и тем сократить 
время фракционирования в 2 — 3 раза.

Выбор значения Т зависит от природы различия электрофо- 
ретических подвижностей белков в геле. Если сильно различа- 
ются размеры молекул, а отношение заряда к массе у них более 
или менее одинаково, то имеет смысл выбрать Т максимальным. 
Разделение в этом случае будет происходить только за счет 
трения о гель, причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при 
этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза 
усилится диффузия белков. Если же компоненты анализируемой 
смеси имеют различные отношения заряда к массе, то может 
оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле при малых значениях Т), т. е. как бы в свободной жидкости, 
почти не используя эффект трения молекул о гель. По крайней 
мере, это обеспечит выигрыш во времени фракционирования.

Ориентировочно о характере  различия электрофоретических 
подвижностей двух белков в данных условиях разделения мож- 
но судить в том случае, когда известны их молекулярные мас- 
сы и изоэлектрические точки, а также содержание в них ионо- 
генных аминокислот. Чаще всего бывают, хотя бы приблизитель- 
но, известны молекулярные массы. Если они различаются не- 
значительно, то имеет смысл ориентироваться сначала на круп- 
нопористый гель и попробовать поварьировать рН буфера.

Пожалуй, самый существенный вывод  из проведенного каче- 
ственного рассмотрения — заключение об определенной свобо- 
де выбора концентрации ПААГ и, особенно, содержания в нем 
«сшивки» (С в пределах 2 — 5). В любом случае выбор значений 
Т должен быть сделан на основе ряда пробных опытов, в кото- 
рых, в частности, следует варьировать рН буфера и продолжи- 
тельность электрофореза (электрофорез белков в присутствии 
додецилсульфата натрия пока не рассматривается).

В качестве сугубо ориентировочной можно рекомендовать 
следующую полученную на практике таблицу соответствия мо- 
лекулярных масс разделяемых белков (М) и концентраций 
ПААГ (Т):

Приступая к электрофоретическому фракционированию био- 
полимеров, необязательно в точности воспроизводить значения 
Т и С, приведенные в литературе для сходного типа эксперимен- 
тов, но выбранные однажды условия следует, разумеется, точно 
воспроизводить в собственной серии опытов для надежной иден- 
тификации и сопоставления положения соответствующих полос .

Электрофорез белков

Миграция белков в геле

Ранее было показано, что электрофоретическая  подвижность 
биополимеров в геле (и') пропорциональна их подвижности в 
свободной жидкости (u_о), которая определяется отношением 
суммарного заряда макромолекулы к ее массе. Фактором, об- 
условливающим отличие и' от u_о является сила трения о гель, 
которая зависит от соотношения линейных размеров макромо- 
лекул и пор геля, а следовательно, от молекулярных масс бел- 
ков и концентрации ПААГ. Молекулярные массы подавляюще- 
го большинства индивидуальных белков не превышают 500 000. 
Поэтому использование гелей агарозы оказывается нецелесооб- 
разным, кроме тех случаев, когда разделение белков хотят вести 
только по величине отношения заряда к массе. Как правило,

электрофорез белков проводят в  ПААГ, содержащем 5 — 20% 
акриламида.

Белки являются, цвиттерионами. Их суммарным  зарядом, а 
следовательно и отношением заряда к массе, можно управлять 

путем изменения рН буфера, в котором  полимеризуют ПААГ и 
ведут электрофорез и который далее будем именовать рабочим. 
Очевидно, что оптимальное значение рН рабочего буфера обус- 
ловливает не максимальный заряд, а максимальное различие 
зарядов разных белков, составляющих исходную смесь. Поэто- 
му в большинстве случаев нецелесообразно использовать экст- 
ремальные величины рН рабочего буфера, слишком удаленные 
от изоэлектрических точек всех белков смеси. Для обычных 
кислых белков оптимальные значения рН буфера оказываются 
в нейтральной или слабощелочной области; миграция белков 
идет в направлении от катода к аноду. Для щелочных белков 
(гистонов, белков рибосом и др.) целесообразно использовать 
слабокислые буферы (рН 4 — 5). Эти белки различаются по ве- 
личине суммарного положительного заряда и мигрируют в на- 
правлении от анода к катоду.

Несмотря на малое количество фракционируемого белка, от 
рабочего буфера требуется существенная емкость, так как при 
образовании зоны локальная концентрация белка может ока- 
заться значительной. Поэтому приходится использовать буферы 
с концентрацией 0,1 — 0,2 М и более. При этом следует учиты- 
вать, насколько близко к границе буферной области лежит рабо- 
чее значение рН. Если такое приближение к границе необходи- 
мо, то для обеспечения достаточной буферной емкости моляр- 
ность буфера приходится еще увеличивать. Вопрос об электро- 
проводности буферов рассмотрен ниже.

Отметим далее, что эффект трения о гель зависит  не только 
от молекулярной массы, но и от конфигурации и жесткости бел- 
ковой макромолекулы. Глобулярные белки, неспособные к агре- 
гации или диссоциации на субъединицы, ведут себя более или 
менее одинаково, хотя их размеры зависят от плотности упа- 
ковки глобулы. Рыхлые глобулярные и, особенно, фибриллярные 
белки могут деформироваться при взаимодействии с гелем и тем 
самым облегчать себе миграцию между его нитями. Этот эф- 
фект особенно сильно выражен у высокомолекулярных нуклеи- 
новых кислот.

Для однозначного определения молекулярной массы белка 
по скорости его миграции при электрофорезе бывает целесооб- 
разно распрямить полипептидную цепочку белка и придать ей 
жесткость. Именно такой прием используется при электрофоре- 
зе белков, обработанных додецилсульфатом натрия (подробно 
это будет рассмотрено ниже).

Напряженность электрического поля (Н)

Разность потенциалов, или напряжение, приходящееся на 
весь гель, обозначим через Е; тогда для однородного участка 
геля длиной l Е = Нl. В проводящей ток жидкости приложен- 
ному напряжению Е всегда отвечает некоторая сила тока I, ко- 
торая в соответствии с законом Ома определяется суммарным 

сопротивлением цепи R (I=E/R). В ПААГ проводящей жидко- 
стью служит буфер, находящийся между нитями полимера. 
Свой вклад в проводимость вносят и мигрирующие в геле заря- 
женные макромолекулы, но ввиду их низкой концентрации этим 
вкладом можно пренебрегать.

Электрическое сопротивление буфера определяется двумя 
факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электро- 
форетической подвижностью. Второй фактор играет очень важ- 
ную роль. Например, при одинаковых концентрациях в двух бу- 
ферах ионов С1^– и СН₃СОО^– электропроводность первого буфе- 
ра будет заметно выше, чем второго. Следует также помнить о 
том, что электрический ток одинаков по всей длине электриче- 
ской цепи, т. е. в любом сечении трубки или пластины. Разры- 
вов или скачков тока по длине геля физически быть не может, 
это аксиома. Иначе обстоит дело с напряжением или напряжен- 
ностью электрического поля.

Если в любой электрической  цепи последовательно включе- 
ны два различных по своей величине сопротивления R₁ и R₂, то 
одинаковый для всей цепи ток I протекает через первое из них 
за счет падения на нем напряжения Е₁=IR₁, а через второе — за 
счет Е₂=IR₂. Полное напряжение по всей электрической цепи 
Е=Е₁+Е₂. Если R₁ сильно отличается от R₂, то и Е₁ также от- 
личается от E₂. При изменении сопротивлений двух участков рас- 
пределение напряжений на них может существенно измениться, 
оставаясь в сумме своей неизменным.

Такая ситуация может возникать  в ПААГ, состоящем из двух 
последовательно расположенных участков, где при полимериза- 
ции были использованы разные буферы (содержащие ионы с 
разной подвижностью или просто различающиеся по концентра- 
ции). Сопротивления этих участков могут оказаться разными:  
следовательно, различными могут быть и падения напряжения 
на них, но эти параметры зависят от длины участков. Однако 
заведомо будут различаться в рассматриваемом случае значе- 
ния напряженности поля на двух участках. Действительно, па- 
дение напряжения на участке пропорционально его сопротив- 
лению, а следовательно, длине участка. Напряженность же поля 
есть результат деления падения напряжения на длину, поэтому 
соотношение напряженностей поля на двух участках геля не за- 
висит от их длины и определяется только концентрациями и под- 
вижностями содержащихся в них ионов. Это — очень важный 
вывод. В реальных буферных системах геля такую ситуацию 
можно себе представить в двух простейших вариантах.

Вариант 1. Предположим, что буферы и, соответственно, 
ионы на двух участках геля (A и В) одинаковы, но концентра- 
ция буфера на участке A в 10 раз меньше. Это приведет к тому, 
что напряженность поля в А будет вдесятеро больше, чем в В. 
Скорость миграции ионов пропорциональна напряженности поля, 
и ионы на участке А будут мигрировать в 10 раз быстрее, чем 
такие же ионы на участке В; это компенсирует разницу в их 
концентрациях. Число ионов, проходящее за 1 с через любое се- 
чение обоих участков, а также через границу между ними, будет 
одинаковым, что и означает неизменность тока I по всей длине 
составного (ступенчатого) геля. При этом предполагается, что 
количество ионов в A не истощается — оно пополняется за счет 
ионов, поступающих из электродного буфера.

Вариант 2. Теперь допустим, что концентрации ионов на обо- 
их участках одинаковы, но ионы на участке A отличаются на- 
много меньшей электрофоретической подвижностью. Речь идет 
о подвижности в свободной жидкости (u₀), так как сетка геля 
не препятствует миграции малых ионов. Например, пусть в геле 
A содержатся отрицательные ионы глицина (при щелочном рH), 
а в геле В — ионы хлора. Меньшая подвижность ионов обуслов- 
ливает большую величину сопротивления. Суммарное напряже- 
ние распределится между участками A и B так, что напряжен- 
ность поля в A будет соответственно выше, причем именно на- 
столько, чтобы скорость миграции ионов глицина, пропорцио- 
нальная произведению подвижности на напряженность поля, 
стала точно такой же, как и у ионов хлора. Этого опять требует 
условие неизменности величины тока вдоль всего геля.