Валидация аналитических методик

3. Диапазон  применения

Диапазон применения методики зависит от ее назначения и определяется при изучении линейности. В пределах диапазона применения методика должна обеспечивать требуемую линейность, правильность и прецизионность. При проведении валидации испытания на примеси непосредственно в процессе разработки методики необходимо определить диапазон применения, внутри которого находится предполагаемый предел нормирования примесей.

4. Правильность

Правильность  изучают в пределах диапазона применения аналитической методики.

Количественное  определение

 Активная субстанция

Могут использоваться следующие способы определения правильности:

a) применение аналитической методики к образцу с известной степенью чистоты, например к стандартному образцу;

b) сравнение результатов анализа, полученных с использованием валидируемой методики и арбитражного метода, правильность и прецизионность которого известны (использование независимого метода;

c) заключение о правильности можно сделать после того, как установлены прецизионность, линейность и специфичность.

Готовый лекарственный  препарат

Могут использоваться следующие способы определения правильности:

a) применение методики к искусственным смесям, к которым были добавлены известные количества анализируемого вещества;

b) если невозможно получить образцы всех компонентов лекарственного препарата, возможно применение метода добавок или арбитражной методики, правильность которой доказана;

c) заключение о правильности можно сделать после того, как установлены прецизионность, линейность и специфичность.

 Примеси  (количественное содержание)

Правильность  изучают на образцах (субстанции или готового лекарственного препарата) с добавленным известным количеством примесей.. Если примеси неизвестны, то чувствительность их определения может быть принята равной чувствительности определения субстанции. Если чувствительность определения субстанции и примеси существенно отличается, то вводят коэффициент пересчета. Должен быть указан конкретный способ нормирования содержания отдельной примеси или суммы примесей, например, в массовых процентах, в процентах по отношению к площади пика основного анализируемого компонента или др.

 

Представление данных

Правильность  оценивают не менее чем для девяти определений, охватывающих весь диапазон применения (например, три концентрации и три определения для каждой). Определения должны включать все стадии методики.

Правильность  выражают в процентах найденного значения от введенного количества или как разность между средним и истинным значением с учетом соответствующих доверительных интервалов.

5. Прецизионность

Валидационная характеристика прецизионности изучается для методик количественного определения и методик количественного определения примесей.

 Сходимость

Сходимость изучают, выполняя:

a) не менее девяти определений, охватывающих диапазон применения методики (например, три концентрации /три определения для каждой) или

b) не менее шести определений для образцов с содержанием анализируемого вещества, близким к номинальному.

Внутрилабораторная  прецизионность

Устанавливают влияние случайных факторов на прецизионность валидируемой аналитической методики. Типичными исследуемыми факторами являются различные дни, различные аналитики, различное оборудование и т. п. Не считается необходимым изучать влияние каждого фактора отдельно. При изучении влияния различных факторов предпочтительно использовать планирование эксперимента.

Воспроизводимость

Воспроизводимость оценивают путем проведения межлабораторных исследований. Воспроизводимость должна быть изучена при стандартизации аналитической методики, например при включении методики в фармакопею. Эти данные не включают в регистрационное досье.

Представление данных

При изучении прецизионности следует представлять: стандартное отклонение, относительное стандартное отклонение и доверительный интервал.

6. Предел  обнаружения

В зависимости  от того, является ли методика инструментальной или неинструментальной, возможны различные подходы для определения предела обнаружения. Используются следующие подходы.

 

Визуальная  оценка

Визуальную оценку используют как для неинструментальных, так и для инструментальных методов. Предел обнаружения устанавливают путем анализа образцов с известными концентрациями анализируемого вещества и оценкой минимального содержания, при котором анализируемое вещество надежно определяется.

 Соотношение  сигнал/шум

Этот подход применим только к тем методам, для которых наблюдается шум базовой линии. Для определения соотношения сигнал/шум сравнивают величины сигналов, полученные для контрольного опыта и для образцов с низкими концентрациями анализируемого вещества. На основании полученных данных устанавливают минимальную концентрацию, для которой величина отношения сигнал/шум составляет обычно от 3 до 2.

Использование стандартного отклонения сигнала для контрольного опыта

Измеряют величину аналитического сигнала для необходимого числа образцов, не содержащих анализируемое вещество, и вычисляют стандартное отклонение.

Использование калибровочной прямой

Получают калибровочную прямую для образцов с содержанием анализируемого вещества, близким к пределу обнаружения, и вычисляют ее параметры.

 

Представление данных

Представляют  значение предела обнаружения с указанием способа, использованного для его определения. Если определение предела обнаружения основывается на отношении сигнал/шум, представляют соответствующие хроматограммы.

Если значение предела обнаружения получено путем вычислений или экстраполяций, его оценка должна быть подтверждена анализом необходимого числа образцов с содержанием анализируемого вещества, близким к пределу обнаружения.

7. Предел  количественного определения

В зависимости  от того, является ли методика инструментальной или неинструментальной, возможны несколько подходов для установления предела количественного определения. Могут быть использованы следующие подходы.

Визуальная  оценка

Визуальную оценку используют как для неинструментальных, так и для инструментальных методов. Предел количественного определения устанавливают путем анализа образцов с известными концентрациями анализируемого вещества и оценкой минимального содержания, при котором анализируемое вещество определяется количественно с требуемой правильностью и прецизионностью.

Соотношение сигнал/шум

Этот подход применим только к тем методам, для которых наблюдается шум базовой линии. Для определения соотношения сигнал/шум сравнивают величины сигналов, полученные для контрольного опыта (при отсутствии анализируемого вещества), и для образцов с низкими концентрациями анализируемого вещества. На основании по лученных данных устанавливают минимальную концентрацию, для которой величина отношения сигнал/шум составляет около 10:1.

Использование стандартного отклонения сигнала для контрольного опыта

Измеряют величину аналитического сигнала для необходимого числа образцов, не содержащих анализируемое вещество, и вычисляют стандартное отклонение.

Использование калибровочной прямой

Получают калибровочную  прямую для образцов с содержанием анализируемого вещества, близким к пределу количественного определения, и вычисляют ее параметры.

Представление данных

Представляют  значение предела количественного определения с указанием способа, использованного для его определения. Значение предела количественного определения должно быть подтверждено анализом необходимого числа образцов с содержанием анализируемого вещества, близким к пределу количественного определения.

 

8. Робастность

Оценку робастности  проводят на стадии разработки методики с учетом типа изучаемой методики. Эта оценка должна доказать надежность результатов анализа при небольших изменениях параметров методики.

Если на результаты анализа влияют условия его проведения, то эти условия должны быть стандартизированы и в текст методики вносят соответствующие предостережения.

Типичные примеры  изучаемых параметров:

- устойчивость  во времени аналитических растворов;

- время экстракции.

В случае жидкостной хроматографии:

- рН подвижной  фазы;

- состав подвижной  фазы;

- колонки (различные  серии и/или поставщики);

- температура;

- скорость подвижной  фазы.

В случае газовой  хроматографии:

- колонки (различные  серии и/или поставщики);

- температура;

- скорость газа-носителя.

9. Проверка  пригодности системы

Проверка пригодности  системы является составной частью многих аналитических методик. Этот тест основан на представлении о том, что оборудование, электроника, аналитические операции и анализируемые образцы составляют единую систему, которую можно оценивать как целое. Параметры, вводимые в тест «Проверка пригодности аналитической системы», зависят от используемого метода анализа и обосновываются исследованиями по робастности.

 

ВАЛИДАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК: ОСОБЕННОСТИ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ К МЕТОДАМ, ИСПОЛЬЗУЕМЫМ В ФАРМАКОПЕЕ

 

1. Оптическое  вращение

Выбирают растворитель, позволяющий получать максимально возможный угол вращения. Исследуют стабильность угла вращения испытуемого раствора в течение не менее 2 ч. При необходимости указывают, что раствор используют свежеприготовленным (сразу после приготовления). В необходимых случаях указывают время достижения стабильного значения угла вращения.

2. Абсорбционная спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях спектра

Должна быть доказана пригодность выбранных условий определения, таких, как используемые растворители и их качество, рН раствора и т. д. Обычно ультрафиолетовая спектрофотометрия имеет ограниченную специфичность, которую можно повысить использованием первой и второй производной спектра.

3. Цветные реакции или реакции осаждения. Для отдельных катионов и анионов описаны предельные испытания, основанные на визуальном сравнении окраски или опалесценции. При этом необходимо доказать, что:

- окраска, или  опалесценция, для нормируемых концентраций отчетливо видна;

- найденная концентрация добавленного иона одинакова как для испытуемого раствора, так и для раствора сравнения (как визуально, так и с помощью методов, основанных на измерении поглощения);

- значения оптической плотности растворов, содержащих 50%, 100% и 150% анализируемой примеси от нормируемой концентрации, должны значимо различаться;

- определение  примеси на уровне нормируемой концентрации проводят не менее 6 раз и вычисляют стандартное отклонение. Найденная концентрация должна составлять не менее 80% от введенной, а относительное стандартное отклонение — не более 20%. Целесообразно провести сравнение результатов предельного испытания с результатами количественного определения с использованием независимого метода, например атомно-абсорбционной спектрофотометрии для катионов или ионной хроматографии для анионов. Результаты, полученные двумя методами, должны быть близки.

4. Атомно-абсорбционная  спектрометрия

Метод атомно-абсорбционной  спектрометрии (ААС) применяют для испытаний по определению содержания отдельных элементов, присутствующих в образце.

Специфичность

Специфичность данного  метода определяется тем, что атомы анализируемого элемента поглощают характеристическое излучение от источника со строго дискретными длинами волн, соответствующими данному элементу.

Предел  обнаружения и предел количественного определения (основанный на стандартном отклонении контрольного опыта)

Выполняют контрольные  опыты, для которых предпочтительно использовать растворы «плацебо», содержащие все компоненты образца, за исключением определяемого. Если такие контрольные опыты выполнить невозможно, то допустимо использовать холостые растворы, содержащие все реагенты и приготовленные так же, как и испытуемый раствор.

5. Методы  разделения

Хроматографические  методы

Различные хроматографические методы: тонкослойная хроматография (ТСХ), газовая хроматография (ГХ), жидкостная хроматография (ЖХ), — могут использоваться для идентификации, контроля примесей и количественного определения.

 

 

Тонкослойная хроматография

Специфичность.

 Для тестов идентификации обычно нельзя добиться специфичности, используя только тонкослойную хроматографию саму по себе, однако достаточная избирательность может быть достигнута при сочетании ТСХ с другими методами. Если для предельного испытания избирательность недостаточна, то используют дополнительное испытание (испытания), для контроля