Этапы иммуноблоттинга

1. Диагностика антител класса IgM/IgG к ВПГ-1 и ВПГ-2 методом иммуноблоттинга

     Иммуноблот, позволяющий качественно определить наличие в сыворотке или плазме крови человека IgМ-антитела к вирусу простого герпеса 1 и вирусу простого герпеса 2 и/или IgG-антитела к вирусу простого герпеса 1 и вирусу простого герпеса 2.

     Антигены: Источником антигенов для тестов Anti-HSV-1 / HSV-2 EUROLINE-WB (EUROIMMUN, Германия) является полный комплекс антигенов ВПГ-1 и гликопротеин G-2 ВПГ-2, очищенный аффинной хроматографией. Культивируемые вирусы простого герпеса 1 типа разделяются на отдельные вирусные белки с различным молекулярным весом методом прерывистого электрофореза в полиакриламидном геле и эти белки (вирусные антигены) переносятся на нитроцеллюлозную мембрану стрипов. Затем стрипы дополнительно покрываются мембранным чипом, содержащим тонкую линию очищенного гликопротеина G-2 ВПГ-2.

     Результаты  постановки позволяют обнаружить ВПГ-инфекцию 1 и/или 2 типа.  

Реактивная  полоса антигена	Результат
Полос нет совсем или видны полосы неопределенной принадлежности	Отрицательный по антителам к ВПГ-1 и ВПГ-2
Проявляется полоса антигена gC-1 и, по крайней мере одна из полос других антигенов ВПГ-1; нет полосы gG-2 ВПГ-2.	Положительный по антителам к ВПГ-1 и отрицательный по антителам к ВПГ-2
Проявляется только полоса антигена gG-2 ВПГ-2	Отрицательный по антителам к ВПГ-1 и положительный по антителам к ВПГ-2
Проявляется полоса антигена gC-1 и, по крайней мере одна из полос других антигенов ВПГ-1; есть полоса gG-2 ВПГ-2.	Положительный по антителам к ВПГ-1 и положительный по антителам к ВПГ-2

 
Таблица 1. Интерпретация результатов по IgG-антителам

     Для обнаружения IgM-антител постановка теста такая же, как и для IgG, за исключением использования другого  ферментного конъюгата (антител  к IgM человека, конъюгированных с  щелочной фосфатазой).

Реактивная  полоса антигена	Результат
Полос нет совсем или видны полосы неопределенной принадлежности	Отрицательный по антителам к ВПГ-1 и ВПГ-2
Проявляется полоса антигена gC-1 и нет полосы gG-2 ВПГ-2.	Положительный по антителам к ВПГ-1 и отрицательный по антителам к ВПГ-2
Нет полосы антигена gC-1 и проявляется полоса антигена gG-2 ВПГ-2	Отрицательный по антителам к ВПГ-1 и положительный по антителам к ВПГ-2
Проявляется полосы антигенов gC-1 и антигена gG-2 ВПГ-2.	Положительный по антителам к ВПГ-1 и положительный по антителам к ВПГ-2

Таблица 2. Интерпретация результатов по IgМ-антителам

2. Диагностика антител класса IgM/IgG к цитомегаловирусу методом иммуноблоттинга с рекомбинантными антигенами с возможностью определения стадии инфекции

     Иммуноблот  для качественного определения IgG и/или IgM антител против цитомегаловируса в сыворотке или плазме крови  человека. Используется для подтверждения  положительных результатов скрининговых тестов.

     Антигены: Специфические цитомегаловирусные антигены для RecomBlot ЦМВ (MIKROGEN, Германия) производятся с помощью рекомбинантных клеток E.coli. Полученные очищенные рекомбинантные антигены разделяются согласно своему молекулярному весу в полиакриламидном геле с помощью электрофореза, а затем переносятся на нитроцеллюлозную мембрану.

     Вследствие  того, что используются рекомбинантные антигены, чувствительность и специфичность  этого теста выше, чем иммуноблоттинга, где использовались живые культуры вируса (см. следующую главу), поэтому  этот иммуноблот применяют для подтверждения  положительных результатов скрининговых тестов. Однако иммуноблот с электрофоретически разделенными антигенами культивируемых вирусов целесообразно использовать при дифференциальной диагностике  на ранних стадиях инфекции (когда  строгоспецифичные антитела еще  не наработались в достаточном количестве, но по совокупности антител к неспецифичным  антигенам можно судить о начинающейся инфекции).

Нет ЦМВ-специфических  линий    Линии с очень слабой интенсивностью (соответствующие +/-)    Изолированная линия р65 слабой интенсивности (соответствующая +) даже вместе с другими линиями  очень слабой интенсивности (соответствующие +/-)	IgG - отрицательный
Антитела  против р150, по крайней мере, слабой интенсивности (соответствующие +), (обычно также имеются антитела против большего числа антигенов)    р150 отрицательная, СМ2 – хорошо видимой интенсивности (соответствующая 2+) и, по крайней мере, одна другая линия слабой интенсивности (соответствующая +)	IgG - положительный
Все другие варианты	IgG - пограничный

Таблица 3. Интерпретация результатов IgG-антител

Нет ЦМВ-специфических  линий   Линии с очень слабой интенсивностью (соответствующие +/-)   Изолированная линия (за исключением р150) слабой интенсивности (соответствующая +), в случае линии  р65 даже вместе с другими линиями  очень слабой интенсивности (соответствующая +/-)	IgМ - отрицательный
Антитела  против р150, по крайней мере, слабой интенсивности (соответствующие +), и по крайней мере, одна другая линия слабой интенсивности (соответствующая +)   Изолированная р150 линия с хорошо видимой интенсивностью (соответствующая 2+)	IgМ - положительный
Все другие варианты	IgМ - пограничный

Таблица 4. Интерпретация результатов IgМ-антител

     Серологический  иммунный ответ у человека к ЦМВ-инфекции высоко вариабелен. IgM-антитела могут  персистировать несколько лет после  инфекции, а при первичной ифекции  могут быть очень низкие или даже неопределяемые уровни IgM-антител. Для  оценки иммунного статуса при  ЦМВ-инфекции IgG и IgM-антитела должны всегда рассматриваться вместе.

3. Диагностика антител класса IgM/IgG к цитомегаловирусу методом иммуноблоттинга

     Иммуноблот  для качественного определения IgG и/или IgM антител против цитомегаловируса в сыворотке или плазме человека.

     Антигены: Источник антигенов для набора Anti-CMV-WESTERNBLOT (EUROIMMUN, Германия) получают из детально подобранных штаммов ЦМВ. Искусственно выращенный ЦМВ солюбилизировали с помощью додецилсульфата натрия и затем разделили солюбилизированные белки методом электрофореза в полиакриламидном геле в соответствии с их молекулярными массами и переносли разделенные белки на нитроцеллюлозу.

     Для оценки сигнала принимают во внимание положение и интенсивность окрашивания, так как отрицательные сыворотки  дают слабое окрашивание индивидуальных полос. Антигены ЦМВ можно в основном разделить на три категории:

Категория	Антигены
1	Перекрестно-реагирующий  антиген с молекулярной массой 65 кДа и неопределенные антигены.
2	Низко специфичный  антиген с молекулярными массами: 55 кДа, 52 кДа и 38 кДа
3	Высоко специфичные  антигены с молекулярными массами: 130 кДа и 28 кДа.

Таблица 5. Разделение на категории

     Все результаты Anti-CMV-WESTERNBLOT можно разделить  на отрицательные, промежуточные (пограничные) и положительные.

Результат	Характеристики
Отрицательный	Нет полос, или  полоса категории 1, или одна слабая полоса категории 2.
Промежуточный	Слабая полоса категории 3 или более чем одна полоса категории 2. Рекомендуется через несколько недель взять  новый образец и протестировать его снова.
Положительный	Одна полоса категории 3. В дополнение можно видеть много полос категории 1 и 2.

Таблица 6. Интерпретация результатов

4. Диагностика антител класса IgG к вирусу краснухи методом иммуноблоттинга с возможностью определения стадии инфекции

     Иммуноблот, позволяющий качественно определить наличие в сыворотке или плазме крови человека IgG-антитела к антигенам  вируса краснухи с восможностью определения  стадии инфекции. Рекомендован для  прояснения сомнительных IgM-результатов, для дифференцировки первичной  инфекции и реинфекции.

     Антигены: Рекомбинантные антигены (Е2, Е1, С, Е1-Е2-димер) для набора RecomBlot Rubella IgG (MIKROGEN, Германия) получают с помощью овариальных клеток хомяков. Приготовленные очищенные антигены не содержат интерферирующих или перекрестно реагирующих компонентов.

     Кинетинка IgG-антительного ответа к 3-м структурным  антигенам краснухи Е1, Е2 и С различается. Иммунный ответ к антигенам Е1 и С наблюдается быстро, в течение первых недель после инфекции и вакцинации, а иммунный ответ к антигену Е2 отсрочен. Как правило, антитела к Е2 антигену обнаруживаются спустя 3 месяца после инфекции. То есть, если обнаружены антитела к Е2, от начала инфекции прошло как минимум 3 месяца.

     Интенсивность линий на стрипах пациентов сравнивается с контрольным стрипом.  

Линии	Интенсивность	Результат
Нет реактивности	-	Отрицательный
Очень слабая интенсивность (слабее чем слабоположительный Е2 контроль)	+/-	Пограничный
Слабая  интенсивность (такой же интенсивности, как слабоположительный Е2 котроль)	+	Положительный
Сильная интенсивность (сильнее, чем слабоположительный Е2 контроль)	++	Положительный

 

 Таблица 7. Оценка интенсивности линий

Е1-Е2 С Е1	Е2	Стадия  инфекции
Линии не определены +	Отрицательный	Нет IgG антител против вируса краснухи Свежая  инфекция не может быть исключена
Одна  или более линий определены +	Отрицательный	Присутствуют  IgG антитела против вируса краснухи Не вырабатываются антитела против Е2 Возможна  свежая инфекция
Одна  или более линий определены +	Положительный	Контакт с антигеном  вируса краснухи был более, чем 3 месяца назад

Таблица 8. Интерпретация теста

     Отрицательный результат теста не может исключать  инфекцию краснухи. Возможно, что антитела к краснухи еще не выработались или  присутствуют в неопределяемом количестве, особенно на ранней фазе инфекции.

     Если  имеют место сомнительные результаты теста, рекомендуется обследовать  пациента в динамике.  

5. Диагностика антител класса IgМ  к инфекциям TORCH-комплекса  методом иммуноблоттинга

     Иммуноблот  для качественного дифференцированного  определения IgM-антител в сыворотке  или плазме крови человека к токсоплазме, вирусу краснухи, цитомегаловирусу, ВПГ-1 и ВПГ-2.

     Антигены: Наборы содержат тестовые стрипы-мембраны, на которые нанесены клинически значимые антигены в определенном порядке (Лайн-блот). Источником антигенов для теста TORCH Profile EUROLINE IgM (EUROIMMUN, Германия) являются:

     Токсоплазма: лизат культуры Toxoplasma gondii, обработанный ультразвуком и γ-лучами.

     Краснуха: антигены получены путем инактивации  лизата клеточной культуры Vero, инфицированной вирусом краснухи штамма "HPV-77".

     Цитомегаловирус: инактивированный клеточный лизат  культуры MRC-5, инфицированной цитомегаловирусом  штамма "AD169".

     ВПГ-1: выделенный гликопротеин С1.