Этапы иммуноблоттинга

    ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

    КУРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ  ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ  И СОЦИАЛЬНОМУ  РАЗВИТИЮ 
 

    Кафедра клинической иммунологии и аллергологии 

    Самостоятельная работа

    на  тему «Иммуноблоттинг» 
 
 
 
 
 
 
 
 

    Выполнил  студент 2 курса 2 группы                                    Красников П.А.

    Проверила                                                                               Русанова Т.С. 
 
 

    Курск-2012

    Содержание

    Введение

1. Иммуноблоттинг
1. Первый этап: иммуноэлектрофорез
2. Второй этап: блоттинг
2. Применение метода
1. Диагностика антител класса IgM/IgG к ВПГ-1 и ВПГ-2 методом иммуноблоттинга
2. Диагностика антител класса IgM/IgG к цитомегаловирусу методом иммуноблоттинга с рекомбинантными антигенами с возможностью определения стадии инфекции
3. Диагностика антител класса IgM/IgG к цитомегаловирусу методом иммуноблоттинга
4. Диагностика антител класса IgG к вирусу краснухи методом иммуноблоттинга с возможностью определения стадии инфекции
5. Диагностика антител класса IgМ к инфекциям TORCH-комплекса методом иммуноблоттинга
6. Диагностика антител класса IgМ/IgG к вирусу Эпштейна-Барра методом иммуноблоттинга с возможностью определения стадии инфекции
7. Диагностика антител класса IgG к вирусу гепатита С методом иммуноблоттинга
3. Правила забора биоматериала для исследования на иммуноблоте

Заключение

Список  литературы 
 
 
 
 
 
 

Введение 

      Идеология лабораторного анализа в медицине основана на понимании любого заболевания  как реакции целого организма. Патологическое изменение функции какого-либо органа, ткани,  группы клеток вызывает отклонение от нормальных показателей в работе других органов, тканей, систем. Наряду с неспецифическим, т. е. свойственным для многих видов патологии проявлением  таких сдвигов, в большинстве  случаев наблюдаются особые, характерные  лишь для данного  заболевания  изменения внутренней среды организма. При инфекционных заболеваниях - это, прежде всего, появление во внутренней среде организма возбудителя  или его продуктов (токсины, антигены и т.д.) и иммунный ответ на возбудитель. 

      В связи с этим иммунодиагностика  инфекционных заболеваний может  быть разделена на две части. Во-первых, это определение изменения функциональной активности различных компонентов  иммунной системы, характерных для  здорового организма: изменение  количества лимфоцитов различных популяций, их соотношения, активности клеток системы  мононуклеарных фагоцитов, концентрации иммуноглобулинов и т.п. Во-вторых, это  специфическое распознавание маркеров  возбудителя и реагирующих с  ним комплементарных структур (прежде всего антител) на основе их взаимодействия с микробными антигенами.  

      Наиболее  значимыми для специфической  диагностики инфекционного процесса стали методы иммунохимического  анализа (immunoassay) одним из которых и является метод иммуноблоттинга. 
 
 
 
 
 

1. Иммуноблоттинг

 

     Иммуноблоттинг (син. вестернблоттинг) - высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и  ИФА или РИА.

      Материалом  для исследования является сыворотка  или плазма крови человека. Для  исследования на одном стрипе необходимо 1,5-2 мл крови или 15-25 мкл сыворотки. 

      

      Рис. 2. Пример результативности иммуноблоттинга 

1. Первый  этап: иммуноэлектрофорез

     Иммуноэлектрофорез  помогает идентифицировать антигены по электрофоретической подвижности, особенно в том случае, когда в  образце присутствуют и другие антигены. С помощью данного метода в  клинической иммунологии полуколичественно  определяют концентрацию иммуноглобулинов и идентифицируют миеломные белки.

     На  основе сочетания электрофореза  с иммуноперципитацией разработано  несколько удачных 

     методов, в каждом из которых перемещение  антигена в электрическом поле приводит к его контакту с антителами. Встречный  иммуноэлектрофорез может применяться  для определения антигенов, мигрирующих  в агаре к положительно заряженному  электроду. Данный метод занимает меньше времени и более чувствителен, чем двойная диффузия по Ухтерлони. Его применяют для идентификации  антигенов вируса гепатита В и  соответствующих антител, антител  к ДНК при системной красной  волчанке, аутоантител к растворимым  ядерным антигенам при коллагенозах, а также антител (преципитинов) к Aspergillus при аллергическом бронхолегочном аспергиллезе. Ракетный электрофорез-это  количественный метод, предусматривающий  внесение антигена в гель, содержащий антитела. Линия преципитации имеет  форму ракеты , длина которой определяется концентрацией антигена. Как и  встречный электрофорез, это-быстрый  метод, но и здесь антиген должен перемещаться к положительно заряженному  электроду. Таким образом, ракетный электрофорез подходит для белков, например альбумина, трансферрина и  церулоплазмина, в то время как  концентрацию иммуноглобулинов обычно определяют методом простой радиальной иммунодиффузии. Один из наиболее удачных  вариантов ракетного электрофореза - двухмерный или перекрестный иммуноэлектрофорез Лорелла. При этом на первом этапе  смесь антигенов электрофоретически разделяют в геле агарозы. Затем  разделенные белки вновь заставляют диффундировать в геле под влиянием электрического поля в другом

 

Рис. 2. Виды иммуноэлектрофореза А- простой иммуноэлектрофорез; Б- встречный иммуноэлектрофорез; В - ракетный иммуноэлектрофорез; Г - двумерный иммуноэлектрофорез. Стрелки - направление движение АГ и АТ в электрическом поле. 

направлении, перпендикулярном первому. Таким образом  удалось количественно определить каждый из антигенов смеси. Наиболее впечатляющий пример- это оценка степени  конверсии СЗ в инактивированную форму СЗс, которая часто происходит при обострении в сыворотке больных  системной красной волчанкой  или синовиальной жидкости пораженных суставов в острой фазе ревматоидного  артрита, а также в других случаях.  

2. Второй  этап: блоттинг

     После разделения сложной смеси белков методом электрофореза в полиакриламидном или ага- розном геле их можно перенести  из геля на

     

 Рис. 3.  Схема иммуноблотинга 

микропористую нитроцеллюлозную мембрану. Далее неспецифически связанные с мембраной антигены могут быть идентифицированы с помощью  меченых антител. Данный метод получил  широкое распространение. Например, он используется для идентификации  компонентов нейрофиламентов, которые  предварительно разделяют в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата  натрия (ДСН).

  Рис. 4.  Пример  иммуноблотинга  

     Разумеется, если антиген необратимо денатурируется ДСН, то такая методика использоваться не может. Если белки антисывороткк  разделить изоэлектрофокусированием, а затем перенести (это и называется блоттингом) на мембрану, то с помощью меченого антигена можно установить и так называемый спектротип антисыворотки, т.е. определить изотип антител, взаимодействующих с данным антигеном.

Гель с исследуемым образцом после электрофореза

Хемилюминесцентное  определение

Усиление 

  окраски

Коньюгаты золота

Инкубация с реагентом

Инкубация со специфическими антителами

Блок  неспецифических  мест связывания

Аннионые  красители

Определение антигена

Определение белков

Перенос разделенных белков на мембрану

 
 

      

Красители из коллоидного золота

Биотиновые  плашки для блоттинга

 

Амидо черный или кумаси синий      (R-250)

Усиление  окраски

4- хлоро - 1 -нафтол (4CN)

 
 
 
 
 

Коньюгаты биотина, стрептовидин

Коньюгаты щелочной фосфатазы

Коньюгаты пероксидазы хрена

 

4хлоро-1-нафтол, 3,3’-диамино- бензидин (DAB)

5-бромо-4-хлоро-3-индол  фосфат (BCIP),

нитросиний  тетразоль (NBT)

 
 
 
 

Схема 1. Основные методы окраски в иммуноблотинге (Western-blot). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

2. Применение  метода

 

     Чаще  всего использует иммуноблоттинговые наборы для выявления антител к возбудителям различных заболеваний фирмы "EUROIMMUN" (Германия), "MIKROGEN" (Германия):

     - ВПГ 1 и ВПГ 2 IgM/IgG (герпесвирусная инфекция

     - ЦМВ IgM/IgG (цитомегаловирусная инфекция)

     - Краснуха IgG

     - TORCH-профиль IgM (Токсоплазмоз, Краснуха, Цитомегаловирус, ВПГ 1 и ВПГ 2)

     - ВЭБ IgM/IgG (вирусная инфекция Эпштейна-Барра)

     - ВГС IgG (вирусный гепатит С)

     Используют  наборы двух типов - вестерн-блот и лайн-блот.

     Вестерн-блот: Наборы содержат тестовые стрипы-мембраны с электрофоретически разделенными нативными антигенами соответствующих  инфекционных агентов, т.о. антигены располагаются  в порядке молекулярной массы (рис. 5). На мембраны могут быть также нанесены 1-2 дополнительные линии с клинически значимыми антигенами (вестерн-лайн блот). Это надежный подтверждающий метод, исключает ложноположительные ответы и перекрестные реакции.

Рис. 5. Вестерн-блот для  диагностики ВЭБ-инфекции

     Лайн-блот: В этом случае на тестовые стрип-мембраны нанесены только клинически значимые антигены (нативные, синтетические  или рекомбинантные) в определенном порядке. Такой подход используется при дифференциальной диагностике  нескольких инфекций на одном стрипе (рис.6).

Рис. 6. Лайн-блот для диагностики TORCH-инфекций

     Возможность обнаружить антитела к конкретным антигенам  возбудителя позволяет оценить  значимость этих антител (специфичность  для данного этиологического  агента), исключить реакцию на перекрестные антигены. Это и отличает иммуноблоттинг от ИФА, где в качестве антигена могут  быть использованы различные комбинации антигенных детерминант - как специфичные, так и нет, дающих перекрестные реакции  с другими возбудителями. В другом случае, при получении положительного результата в ИФА можно только предполагать, что он является следствием перекрестного реагирования, а в  случае иммуноблоттинга это доказательно.