Лабораторные методы диагностики менингита

Успешное применение РИФ для  прямой детекции вируса в клиническом материале возможно лишь в случае содержания в нем достаточно большого числа инфицированных клеток и незначительной контаминации микроорганизмами, которые могут давать неспецифическое свечение.

Иммуноферментный  анализ (ИФА). Иммуноферментные методы определения вирусных антигенов в принципе сходны с РИФ, но основываются на мечении антител ферментами, а не красителями. Наиболее широко используется пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, применяют также b-галактозидазу и b-лактамазы. Меченые антитела связываются с антигеном, и такой комплекс обнаруживается при добавлении субстрата для фермента, с которым конъюгированы антитела. Конечный продукт реакции может быть в виде нерастворимого осадка, и тогда учет проводится с помощью обычного светового микроскопа, или в виде растворимого продукта, который обычно окрашен (или может флюоресцировать или люминесцировать) и регистрируется инструментально. Поскольку с помощью ИФА можно измерять растворимые антигены, то не требуется наличия интактных клеток в образце и таким образом могут использоваться различные виды клинического материала.

Радиоиммунный анализ (РИА). Метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивало высокую чувствительность в определении вирусного антигена. Широкое распространение метод получил в 80-е годы, особенно для определения некультивируемых вирусов. К недостаткам метода относится необходимость работать с радиоактивными веществами и использования дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).

Молекулярные  методы. Первоначально классическим методом выявления вирусного генома считался высокоспецифичный метод гибридизации нуклеиновых кислот, но в настоящее время все шире используется выделение геномов вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот (НК). Метод основан на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК с образованием двунитевых структур и на выявлении их с помощью метки. Для этой цели используются специальные ДНК- или РНК-зонды, меченные изотопом (³²Р) или биотином, обнаруживающие комплементарные нити ДНК или РНК.

Существуют несколько вариантов  метода:

– точечная гибридизация – выделенную и денатурированную нуклеиновую кислоту наносят на фильтры и затем добавляют меченый зонд; индикация результатов – авторадиография при использовании ³²Р или окраска – при авидин-биотине;

– блот-гибридизация – метод выделения фрагментов НК, нарезанных рестрикционными эндонуклеазами из суммарной ДНК и перенесенных на нитроцеллюлозные фильтры и тестируемые мечеными зондами;

– гибридизация in situ – позволяет определять НК в инфицированных клетках.

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок – так называемых праймеров.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число  копий синтезируемого участка. Вновь  синтезированные фрагменты ДНК  служат в качестве матрицы для  синтеза новых нитей в следующем  цикле амплификации, что позволяет  за 25–35 циклов наработать достаточное  число копий выбранного участка  ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в  агарозном геле.

Метод высокоспецифичен и очень чувствителен. Он позволяет обнаружить несколько копий вирусной ДНК в исследуемом материале. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Разработан вариант количественной ПЦР, позволяющий определять число копий амплифицированного сайта ДНК [2, 7].

Непрямые методы диагностики.

Выделение вирусов – один из самых старых и трудоемких методов диагностики. Однако и сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики – так называемый "золотой стандарт". Процесс длительный, иногда требующий проведения нескольких пассажей, прежде чем вирус будет обнаружен и идентифицирован с помощью одного или нескольких методов – в реакции нейтрализации (РН), РИФ, ИФА или ПЦР.

Серодиагностика

Серологическая диагностика, основанная на реакции антиген – антитело, может быть использована для определения как тех, так и других, и играет роль в определении этиологии вирусной инфекции даже при отрицательных результатах выделения вируса. Успех серологической диагностики зависит от специфичности реакции и соблюдения временных условий взятия крови, необходимых для синтеза организмом антител.

В большинстве случаев используют парные сыворотки крови, взятые с  интервалом в 2–3 нед. Положительной реакция считается по крайней мере при 4-кратном нарастании титра антител. Известно, что большинство специфических антител относятся к классам IgG и IgM, которые синтезируются в различное время инфекционного процесса. При этом IgM антитела относятся к ранним, и тесты, используемые для их определения, применяются для ранней диагностики (достаточно исследовать одну сыворотку). Антитела класса IgG синтезируются позже и длительно сохраняются.

Для типирования вирусов применяется  РН (реакция нейтрализации), при группоспецифической диагностике, например, аденовирусной инфекции, используют реакцию связывания комплемента (РСК). Наиболее употребительнымий являются реакция торможения гемагглютинации (РТГА), РСК, РИФ, реакции пассивной и обратной пассивной гемагглютинации (РПГА, РОПГА), различные варианты ИФА, практически повсеместно заменившего равный ему по чувствительности РИА [2, 7].

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Количество методов, используемых для диагностики вирусных инфекций, непрерывно растет. Одни уходят в прошлое  и имеют в основном историческое значение, другие совершенствуются. Несомненно, что технический прогресс в определении  антител, белкового анализа и  генодиагностики наряду с расширением наших знаний вирусов и патогенеза вирусных инфекций приведут к появлению новых высокоспецифичных и высокочувствительных методов, удобных для клинического применения.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Благонравова А.С., Ковалишена О.В.,  Широкова И.Ю. Современные лабораторные методы исследования в диагностике инфекционных заболеваний// Ремедиум Приволжье,  2012. –  № 2. [1]
2. Богадельников И., Кушнир Г. Лабораторные методы диагностики при нарушении функции ЦНС при инфекционных болезнях у детей/ И. Богадельников, Г. Кушнир // Поликлиника, 2012 . — № 2/2 . — С. 25-29 [2]
3. Долгих Т.И. Современные возможности лабораторной диагностики инфекционных заболеваний (методы, алгоритмы, интерпретация результатов). Пособие для врачей. – Омск, 2005. – 40 с. [3]
4. Комарова Т. В. Серозный менингит энтеровирусной этиологии у детей: клинико-патогенетические особенности в период эпидемического подъема.   Автореферат дис. канд. мед. наук. Самара, 2012. 28 c. [4]
5. Макарова Т.Е., Савосина Г.В., Константинов С.В., Горбатко Т.А., Отводникова Н.И.,. Капура Т.А, Чевозеров С.С. К вопросу о диагностике серозно-вирусного менингита энтеровирусной этиологии у детей// Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии, 2008. – № 12 [5]
6. Методические указания МУ 3.1.1. 2130 – 06 Энтеровирусные заболевания: клиника, лабораторная диагностика, эпидемиология, профилактика, 09.09.06.[6]
7. Носик Н.Н., Стаханова В.М. Лабораторная диагностика вирусных инфекций// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2000. – Т. 2, № 2. – С. 70-78 [7]
8. Петров В. А., Арова А. А., Крамарь Л. В. Менингиты у детей. Клиника, диагностика, лечение и диспансерное наблюдение за реконвалесцентами: Учебно-методическое пособие. – Волгоград, 2003. – 50с. [8]