Диагностическая эффективность отечественной тест-системы «Лайн-блот cифилис» для диагностики сифилиса методом иммуноблоттинга

C.Г. Марданлы¹, В.А. Арсеньева¹, Н.В. Фриго², С.В. Ротанов², Е.А. Амелина¹, М.В. Захаров¹

 

S.G. Mardanly¹, V.A. Arsenyeva¹, S.V. Rotanov², N.V. Frigo², E.A. Amelina¹, M.V. Zakharov¹

 

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «ЛАЙН-БЛОТ CИФИЛИС» ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА МЕТОДОМ ЛИНЕЙНОГО ИММУНОБЛОТТИНГА

 

¹ – ЗАО «ЭКОлаб», г. Электрогорск

² – ФГУ «ГНДЦ Росмедтехнологий», г. Москва

 

Марданлы Сейфаддин Гашимович - президент ЗАО «ЭКОлаб», академик РАМТН, г. Электрогорск, к.м.н. ЗАО «ЭКОлаб» 142530 РФ, Московская область г. Электрогорск, ул. Буденного д. 1, тел. . 8-496-433-17-45 ekolab-president@mail.ru

 

Арсеньева Вероника Алексеевна –  старший микробиолог отдела перспективных  разработок ЗАО «ЭКОлаб», г. Электрогорск. ЗАО «ЭКОлаб» 142530 РФ, Московская область г. Электрогорск, ул. Буденного д. 1, тел. 8-496-433-38-69, va100001@mail.ru

 

Фриго Наталия Владиславовна –  главный научный сотрудник, заведующий отделом лабораторной диагностики  ИППП и болезней кожи ФГУ «ГНДЦ  Росмедтехнологий», г. Москва, д.м.н.

 

Ротанов Сергей Владимирович – ведущий  научный сотрудник отделения лабораторной диагностики сифилиса отдела лабораторной диагностики ИППП и болезней кожи ФГУ «ГНДЦ Росмедтехнологий», г. Москва, д.м.н., доцент

 

Амелина Елена Анатольевна –  начальник отдела перспективных разработок ЗАО «ЭКОлаб», г. Электрогорск, к.б.н. ЗАО «ЭКОлаб» 142530 РФ, Московская область г. Электрогорск, ул. Буденного д. 1, тел. 8-496-433-37-31, ekolab-ferment@mail.ru

 

Захаров Михаил Владимирович - начальник  лаборатории белковой инженерии ЗАО «ЭКОлаб», г. Электрогорск, к.б.н. ЗАО «ЭКОлаб» 142530 РФ, Московская область г. Электрогорск, ул. Буденного д. 1, тел. 8-496-433-38-69, ekolab-lab@mail.ru

 

C.Г. Марданлы¹, В.А. Арсеньева¹, С.В. Ротанов², Н.В. Фриго², Е.А. Амелина¹, М.В. Захаров¹

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ  ОТЕЧЕСТВЕННОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «ЛАЙН-БЛОТ CИФИЛИС» ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА МЕТОДОМ ЛИНЕЙНОГО ИММУНОБЛОТТИНГА

Разработана новая отечественная  тест-система «Лайн-Блот Сифилис» (ЗАО «ЭКОлаб») на основе метода линейного иммуноблотинга с использованием рекомбинантных антигенов Treponema Pallidum. В представленной работе диагностическая значимость диагностикума «Лайн-Блот Cифилис» оценивалась в формате подтверждающего теста. В рамках проведенного исследования, тест-система показала абсолютную чувствительность и специфичность по отношению к серопозитивным (n=237) и серонегативным (n=114) образцам, наличие или отсутствие в которых антител против Т.pallidum было установлено двумя трепонемными тестами. При исследовании 14 образцов, отнесенных на основании результатов двух тестов (РПГА и РИФабс) в группу сомнительных аналитов, соответствие данных, полученных в тест-системе «Лайн-Блот Cифилис», с данными «INNO-LIA Syphilis score» составило 100% (14/14), с ИФА - 93% (13/14), а с РИФабс - 57% (8/14). Рекомендовано использовать тест-систему «Лайн-Блот Сифилис» (ЗАО «ЭКОлаб») в качестве подтверждающего теста на сифилис.

 

Ключевые слова: диагностика сифилиса, иммуноблотинг

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение. Сифилис - инфекционное заболевание человека, вызываемое T. pallidum, лабораторная диагностика которого проводится с использованием микробиологических и серологических методов исследования [1]. Высокая локальная концентрация инфекционного агента в местах его внедрения в организм человека при первичном и вторичном сифилисе позволяет выявлять T. pallidum микробиологическими методами, что является абсолютным критерием окончательного диагноза [2]. При других стадиях и формах сифилитической инфекции возможности прямых микробиологических тестов ограничены, прежде всего, ввиду отсутствия или низкой концентрации T. pallidum в исследуемом биологическом материале.

Современная серологическая диагностика сифилиса, исключая скрининговые обследования, носит комплексный  характер. Применение двух методов: нетрепонемного и трепонемного, - направленных на выявление серологических маркеров инфекции, позволяет увеличить вероятность постановки правильного предварительного диагноза [1, 3].

Следует отметить, что ни один из используемых на сегодняшний  день серологических тестов не обладает 100% специфичностью [4, 5]. В ряде случаев на фоне отсутствия клинических проявлений инфекции для постановки предварительного диагноза требуется привлечение всего арсенала специфических (трепонемных) диагностических тестов. В связи с этим актуальной проблемой сифилидологии является разработка новых отечественных диагностических наборов для диагностики сифилиса, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью, направленных на сокращение объема необходимых серологических исследований [6].

Тесты, основанные на детекции флуоресцентного сигнала (реакция  иммунофлюоресценции - РИФ), считаются  одними из лучших тестов на сифилис [7]. РИФ чувствительна на всех стадиях  инфекции, применяется как подтверждающая реакция при раннем, скрытом сифилисе и при установлении ретроспективного диагноза. Несмотря на высокую диагностическую ценность, широкому внедрению РИФабс в повседневную практику препятствует необходимость использования живой T. pallidum, высокая стоимость и длительность проведения исследования. Кроме того, оценка результатов РИФ носит субъективный характер.

В последние годы за рубежом  для серодиагностики сифилиса начали активно использовать метод иммуноблоттинга. Существует несколько коммерческих тест-систем на основе данного метода. Одни из них выполнены в формате вестерн-блота, состоят из стрипов, на которые перенесены белковые компоненты T. pallidum, предварительно разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле [8, 9]. Другие, как, например, зарегистрированная в России тест-система «INNO-LIA Syphilis Score» (Innogenetics, Бельгия) [10], выполнены в формате линейного блота, состоят из стрипов, на которых в виде дискретных линий сорбированы рекомбинантные и синтетические полипептиды – аналоги поверхностных антигенов T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA [11]. Результаты вестерн-блота трудно интерпретировать, так как на стрипах выявляется большое разнообразие антител, многие из которых являются группоспецифическими [12]. Напротив, интерпретация результатов линейного блота не вызывает затруднений; кроме того, дополнительные контрольные линии, нанесенные на стрип, позволяют проводить полуколичественную оценку уровня антител к четырем антигенам T. pallidum [10]. При проведении сравнительного изучения диагностической эффективности тест-системы «INNO-LIA Syphilis Score» со стандартными серологическими методами (РМП, ИФА, РПГА, РИФабс) авторами работы [13] установлена 99.6% чувствительность и 99.5% специфичность линейного иммуноблоттинга. При этом тест-система не давала положительных результатов при обследовании 90 сывороток, полученных от пациентов с болезнью Лайма и аутоиммунными заболеваниями [10]. В исследованиях, проведенных отечественными исследователями, также была подтверждена высокая чувствительность (100%) и специфичность (98%) тест-системы «INNO-LIA Syphilis Score» [14-16]. Показатели чувствительности линейного иммуноблоттинга превышали чувствительность стандартных нетрепонемных (РМП, РСКк) и трепонемных тестов (РСКт, ИФА, РПГА) при первичном и раннем скрытом сифилисе. При обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом, положительный результат в «INNO-LIA Syphilis Score» был получен у 36% пациентов, в РМП – у 7%, в ИФА - у 21%, в то время как другие реакции (РСКТ, РСКК, РИФабс и РПГА) дали отрицательный результат [16]. Проведенные исследования позволили рекомендовать метод иммуноблоттинга в качестве подтверждающего теста на сифилис как дополнительного либо альтернативного РИТ и РИФабс [13, 15]. Несмотря на то, что в настоящее время существуют технические возможности автоматизации процедуры использования тест-системы «INNO-LIA Syphilis Score», ее широкому применению в лабораторной практике препятствует высокая стоимость и длительность процедуры исследования [3].

Целью настоящей работы явились разработка и изучение диагностической эффективности отечественной тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» для диагностики сифилиса методом линейного иммуноблоттинга,  разработанной ЗАО «ЭКОлаб».

Материалы и  методы. Диагностическая тест-система «Лайн-Блот Cифилис» производства ЗАО «ЭКОлаб» (ТУ 9398-118-70423725-2009; Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/06925 от 01 марта 2010г) представляет собой набор реагентов, рассчитанный на проведение 24 исследований, позволяющих полуколичественно оценивать в ликворе, плазме и сыворотке крови человека титр IgG - антител против четырех антигенов T. pallidum: TpN15, TpN17, TpN47 и ТmрА.

В состав набора входят:

- 10-кратный концентрат  промывочного раствора (ПР);

- раствор для разведения  исследуемых образцов (РРО);

- конъюгат (представляет  собой козьи антитела к IgG человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой);

- раствор для разведения  конъюгата; 

- раствор хромогенного  субстрата для выявления ферментативной  активности щелочной фосфотазы;

- контрольные образцы  (К+ и К-), представляющие собой  сыворотки крови человека, содержащие и несодержащие антитела к T рallidum;

-тест-полоски (стрипы) из нитроцеллюлозной мембраны, на которые в виде дискретных линий нанесены четыре рекомбинантных белка T рallidum: TpN15, TpN17, TpN47 и ТmрА.

Кроме линий (зон) рекомбинантных антигенов, на каждом стрипе имеются четыре контрольные линии: линия контроля антигена (Каг) – зона нанесения рекомбинантного белка тиоредоксина E.сoli - служит для оценки корректности проведения теста на исследуемом образце (при правильном проведенном исследовании эта полоса не окрашивается); три калибровочные линии, содержащие иммобилизованные IgG человека, которые при проведении исследования дают зоны дискретно уменьшающейся интенсивности окрашивания, соответствующие баллам 3+, 1+, 0,5+ (cut off); калибровочная линия, соответствующая 1+ одновременно служит контролем внесения образца биологического материала (рис. 1).

Процедура исследования образцов (сывороток, плазмы и ликвора) с использованием тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» проводится при комнатной температуре (20-25^оС). Стрип погружают в 1 мл РРО, содержащий 20 мкл исследуемого образца (разведение 1:50), инкубируют в течение 2 часов. После четырех 5-минутных промывок стрипов однократным ПР к ним добавляют конъюгат (в рабочем разведении), инкубируют в течение 30 мин. Снова выполняют процедуру промывки, как описано выше, добавляют раствор хромогенного субстрата, инкубируют в течение 15 мин . Развитие окраски останавливают посредством 3-х кратной промывки стрипов дистиллированной водой.

Полученные результаты оценивают визуально путем сравнения интенсивности окрашивания зон нанесения антигенов TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA с окрашиванием трех калибровочных линий. Интенсивность окраски каждой линии оценивается следующим образом:

- 0 – нет линии или ее интенсивность ниже, чем интенсивность контрольной линии 0,5+ (Cut off);

-  0,5 – интенсивность линии  равна интенсивности контрольной  линии 0,5+;

- 1 – интенсивность линии больше, чем 0,5+, но меньше либо равна  1,0+;

- 2 - интенсивность линии между  контрольными линиями 1,0+ и 3,0+;

- 3 - интенсивность линии равна  интенсивности контрольной линии 3,0+;

- 4 - интенсивность линии выше, чем  интенсивность контрольной линии  3,0+.

Результат исследования считается:

- отрицательным - при отсутствии окрашенных полос на стрипе или при наличии одной полосы, окрашенной с интенсивностью, равной 0,5;

- сомнительным – при наличии одной полосы, окрашенной с интенсивностью больше или равной 1;

- положительным, если на стрипе  определяются не менее 2 полос,  окрашенных с интенсивностью 0,5 или выше;

- неопределенным - при выявлении  на стрипе линии контроля антигена, окрашенной  с интенсивностью, превышающей интенсивность контрольной линии 0,5+ (Cut off).

Оценку диагностической  эффективности тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» проводили в два этапа. На первом этапе показатели чувствительности и специфичности тест-системы изучались на коллекции аттестованных образцов сывороток крови, входящих в состав панелей контрольных материалов для серодиагностики сифилиса: «Внутрилабораторный контроль антипаллидум» и «Контрольная панель сывороток, содержащих и несодержащих антитела к Т.pallidum» («Вектор-Бест»); «П-АТ-Т.pallidum. Панель сывороток, содержащих и несодержащих антитела к Т. рallidum» и «ВЛ-Контроль-АТ- Т.pallidum» («МБС»); «СОП-антипаллидум» («ЭКОлаб»); «Экспертная панель контрольных сывороток для серодиагностики сифилиса «ЭП СИФИЛИС» (ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий»). Всего было исследовано 64 положительных и 34 отрицательных сывороток, входящих в состав контрольных материалов. Для оценки воспроизводимости результатов с использованием тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» было проведено трехратное повторение исследований с контрольными материалами.

Второй этап включал изучение результатов  работы тест-системы «Лайн-Блот Cифилис»  на 162 образцах сывороток крови и 48 образцах спинномозговой жидкости, полученных от пациентов, проходивших обследование на наличие сифилиса в Городской клинической больнице № 14 имени В.Г. Короленко ДЗ г. Москвы, и на 57 образцах сывороток крови, полученных от здоровых доноров (Станции переливания крови г. Орехово-Зуево). Биологический  материал, полученный от пациентов, был охарактеризован в Городской клинической больнице № 14 с помощью трепонемных тестов (РПГА, РИФабс и/или РИБТ). Образцы были разделены на три группы согласно результатам проведенного исследования. Образцы, давшие положительный результат во всех трепонемных тестах (РПГА, РИФабс/РИБТ), были отнесены в группу «положительных» аналитов; образцы, давшие отрицательный результат во всех трепонемных тестах – в группу «отрицательных» аналитов, образцы, давшие дискордантные результаты, - в группу «сомнительных».

Результаты. При проведении первого этапа исследования с использованием коллекции аттестованных образцов сывороток крови, содержавших (n=64) и не содержавших (n=34)  антитела к Т.pallidum, была установлена 100% чувствительность, специфичность и воспроизводимость тест-системы «Лайн-Блот Cифилис». Во всех исследованных положительных сыворотках наблюдалось 100% выявление антител против TpN17 в титре от 1 до 4 баллов, тогда как титр антител против антигенов TpN15, TpN47 и TmpA колебался в диапазоне – от 0 до 3 баллов. На рисунке 2 и в таблице 1 представлены результаты исследования контрольных материалов из состава набора реагентов «П-АТ-Т.pallidum» и оценка результатов исследования в баллах.

Накопленный на сегодняшний день опыт использования тест-системы «INNO-LIA Syphilis Score» [14-16] указывает, что основным серологическим маркером активного и перенесенного сифилиса являются трепонемоспецифические антитела к антигену TpN17. Как следует из данных, приведенных на рисунке 2 и в таблице 1, тест-система «Лайн-Блот Cифилис» детектировала линию антигена TpN17 во всех положительных образцах набора «П-АТ-Т.pallidum»; в 15 из 16 образцов уровень антител против этого антигена был выше или сравним с уровнем антител против других антигенов, входящих в тест-систему.

На втором этапе диагностическая  эффективность тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» была исследована на 162 образцах сывороток крови и 48 образцах спинномозговой жидкости, полученных от пациентов, проходивших обследование на наличие сифилиса.

В результате тестирования «положительных» аналитов (n=156) с  использованием тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» были получены положительные ответы, согласующиеся с результатами исследования сывороток крови с использованием других трепонемных тестов (РПГА, РИФабс и/или РИБТ) (табл. 2). Образцы сывороток донорской крови (n=57), вошедшие в группу «отрицательных» аналитов, дали негативный результат в тест-системе «Лайн-Блот Cифилис», что также совпадало с результатами исследования данных образцов с помощью других трепонемных тестов. Полученные данные позволили сделать заключение о 100% клинической чувствительности и 100% клинической специфичности тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» при исследовании образцов сыворотки крови. «Сомнительные» образцы (n=6), давшие в РПГА, РИФабс/РИБТ дискордантные результаты, были дифференцированы с помощью тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» следующим образом: как отрицательные (один образец, №3519), положительные (два образца, №1/21 и №3144) и сомнительные (три образца, №23/13657, №5202 и №4/108).

Анализ образцов спинномозговой жидкости в тест-системе «Лайн-Блот Cифилис» (табл. 3) дал согласующиеся результаты с трепонемными тестами (РПГА, РИФабс и/или РИБТ) в отношении «положительных» (n=17) и «отрицательных» (n=23) образцов ликвора, что также позволило сделать заключение о 100% клинической чувствительности и 100% клинической специфичности тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» при исследовании образцов ликвора. «Сомнительные» образцы ликвора (n=8), давшие в РПГА, РИФабс/РИБТ дискордантные результаты, были дифференцированы с помощью тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» следующим образом: как положительные (четыре образца, №13, №17, №10/3424 и №9/3422) и сомнительные (четыре образца, №3, №4, №15 и №16).