Генетика микроорганизмов

* при использовании мутагенных  факторов (УФ-лучей, рентгеновские  лучи, у-лучи, диэтилсульфат и др.) были получены мутанты — продуценты антибиотиков, которые в 100-1000 раз активнее исходных.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. Производства, основанные на использовании микроорганизмов, могут быть рентабельными лишь при условии применения высокоактивных штаммов-продуцентов. Только в этом случае могут быть оправданы все усилия физиологов, технологов и химиков, связанные с разработкой и усовершенствованием процессов ферментации, выделения и очистки целевого продукта. Кроме высокой продуктивности микроорганизмы должны обладать и другими полезными свойствами, обеспечивающими успешное ведение технологического процесса. Сюда относятся скорость роста, устойчивость к повышенной температуре и кислотности среды, фагоустойчивость, стабильность наследования ценных признаков. Все большее значение приобретает способность микроорганизмов-продуцентов усваивать дешевые и доступные субстраты, а также безвредность их для человека и животных. Создание высокоактивных штаммов с заданными свойствами во многом зависит от уровня знаний об организации генома и регуляции метаболизма микробной клетки. Для Е. coli известны молекулярные механизмы репликации ДНК, транскрипции и трансляции, регуляции активности разных генов, лучше всего разработаны приемы генетического конструирования in vivo и in vitro. Именно поэтому первые работы по созданию промышленных штаммов микроорганизмов современными методами выполнены на этом микроорганизме. Распространение методологии генной инженерии на другие объекты требует дополнительных исследований. Как уже было показано, здесь достигнуты значительные успехи — сконструированы удобные векторы для псевдомонад, бацилл, актиномицетов и дрожжей.

Конструирование рекомбинантных ДНК

Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в  пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических  источников. Ключевыми в этом определении  являются слова "фрагмент ДНК" и "объединение  in vitro", что указывает на сущность генетической инженерии и ее отличие от всех остальных методов получения гибридных (или химерных) организмов, таких как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и т.д.

Фрагменты ДНК, в том числе и  фрагменты, содержащие гены, получают с использованием ферментов рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты как с тупыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.

Сшивка  по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод)

Этот метод является самым распространенным и популярным. Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 году. Некоторые  рестриктазы, например Pst I, внося в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образующие "ступеньку" (рис. 1). Эти комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и поэтому их называют комплементарными или липкими концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями, поэтому ААТТ-концы, образуемые Eco RI, не будут спариваться, например, с АГЦТ-концами, образуемыми Hind III. Но любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов.

Рис. 1. Схема   

                 рестриктазно - лигазного

                                               метода

Однако после такого спаривания полной целостности двойной спирали  не восстановится, поскольку останется  два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления, то есть сшивания, или лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию - сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.

Сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод)

Липкие концы не абсолютно необходимы для связывания фрагментов ДНК. Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 году Полем Бергом в Стенфордском университете, США. Липкие концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для этого используют фермент - концевую трансферазу из тимуса теленка, которая присоединяет нуклеотиды к 3 -концам цепей ДНК. Если к 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные олиго (dA)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента — олиго (dT)-сегменты примерно такой же длины, то при смешении полученных таким образом фрагментов происходит спаривание за счет образования водородных связей между олиго (dА)- и олигo (dT) -последовательностями (рис. 2). Для ковалентного соединения двух фрагментов используется ДНК-лигаза. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК.

Рис. 2. Пришивание «липких» концов и сшивка фрагментов ДНК

Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимокомплементарные  одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно ис¬пользуют коннекторный метод. При таком способе соединения между фрагментами встраиваются участки ААААА. Такие дополнительные последовательности ТТТТТ могут влиять на функции соединяемых молекул и поэтому всегда, когда только возможно, для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами, образовавшимися в результате действия рестриктаз.

Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами

В ситуации, когда необходимо сшить  фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу  липкие концы, применяют так называемые линкеры (или "переходники"). Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 году.

Существуют большие наборы таких  генных "переходников". Естественно, что при использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец".

При необходимости липкие концы  можно превратить в тупые. Это  достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента - эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы "застраивают", то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить.

5.       Обычные микроорганизмы не способны синтезировать необходимые человеку вещества, например аминокислоты, в нужном количестве, поэтому работы по микробному синтезу аминокислот состояли в прямой селекции штаммов микроорганизмов, способных накапливать аминокислоты в значительных количестве при росте на средах с большим количеством углерода и меньшим количеством углерода. В этом случае аминокислоты накапливаются в результате нарушения равновесия между углеродным и метаболизмом и ассимиляцией азота. Впоследствии были использованы мутанты микроорганизмов. Многие из них продуцируют одни аминокислоты, но являются дефицитными по другим аминокислотам и витаминам. Для получения мутантов микроорганизмов используют химические и физические мутагены. К химическим мутагенам относятся этиленамин, новоэмбихин, диэтилсульфат, радиоактивные изотопы, тяжелый водород, сильные окислители (HNO₃, KmnO₄); к физическим – рентгеновские лучи, ультрафиолетовые лучи, температурное воздействие. Для получения любой аминокислоты путем микробного синтеза необходимо, чтобы выбранный микроорганизм обладал таким обменом веществ, который обеспечивал бы эффективное превращение источника углерода в одну аминокислоту. Обычно такая особенность микроорганизма настолько неблагоприятна для его выживания, что спонтанно возникающие в природных условиях мутанты неизбежно должны отсеяться в процессе естественного отбора. Поиски подходящих микроорганизмов идут по двум основным линиям. Во-первых, микроорганизмы разных видов – дрожжи, бактерии, грибы – проверяют на их способность накапливать желаемую аминокислоту в культуральной жидкости. Во-вторых, наиболее активные штаммы пытаются затем улучшить, применяя различные мутагенные факторы. 
        В группу мутантов микроорганизмов с измененными биологическими свойствами входят ауксотрофные мутанты и продуценты биологически активных веществ. Ауксотрофными мутантами называют мутанты, потерявшие способность в связи с нарушением нормальных биосинтетических процессов самостоятельно синтезировать те или иные аминокислоты, пурины, пиримидины, витамины. Дефицитность ауксотрофных мутантов по определенным веществам связана с нарушением нормального хода биосинтетических реакций и блокированием отдельных этапов синтеза. В результате блокирования получение конечных продуктов становится невозможным и происходит накопление веществ, получаемых в реакциях, предшествующих блоку. Ауксотрофные мутанты являются патологическими формами, неспособными существовать в обычных условиях, поэтому их культивирование требует поддержания особых условий.

6. Очень большое практическое значение для получения полезных микроорганизмов имеет принцип ступенчатой селекции, или ступенчатого отбора, вместе с тем предотвращается появление новых форм вредных микроорганизмов, устойчивых к тем веществам (различные лекарственные вещества, яды и антибиотики), которые обычно используются для борьбы с этими вредными микроорганизмами.

При помощи ступенчатой селекции получают новые штаммы продуцентов полезных веществ (антибиотики, аминокислоты, витамины и т. д.), способные расти и давать высокую продуктивность на более  дешевых питательных средах. Это  значительно уменьшает стоимость промышленного получения таких полезных веществ.

Установление принципа ступенчатого действия естественного отбора позволило  разработать рекомендации для предотвращения возникновения лекарственно устойчивых форм патогенных микроорганизмов, устойчивых к новым лекарственным веществам и антибиотикам, которые широко используются для лечения заболеваний, вызываемых этими патогенными микроорганизмами. Так, после введения в широкую медицинскую практику сульфанидамидных препаратов их эффективность, в связи с появлением и широким распространением в природе патогенных бактерий, устойчивых к этим лекарственным веществам, сравнительно скоро начала уменьшаться. Несколько позднее то же самое произошло со стрептомицином и пенициллином, что связано с появлением и распространением в природе штаммов патогенных бактерий, устойчивых к этим антибиотикам.  
Возникновение и распространение таких устойчивых штаммов обусловлено лечением, при котором в организме больного накапливается концентрация лекарственного вещества, соответствующая такому уровню устойчивости, который содействует появлению и распространению в природе штаммов, стоящих на этом уровне устойчивости. Последующее повышение доз - до уровня угнетения бактерий к появлению штаммов, стоящих на другом уровне устойчивости, и т. д.

Чтобы предотвратить это крайне нежелательное явление, быстро приводящее к резкому уменьшению эффективности  наиболее ценных новых лечебных препаратов, рекомендуется при лечении использовать концентрации, соответствующие более  высокому уровню устойчивости. Второй путь - применение одновременно двух лечебных препаратов, чтобы случайно появляющиеся мутанты, обладающие более низким уровнем устойчивости по отношению к одному из этих препаратов, устранялись воздействием второго, и обратно.

Развитие формы селекции на повышение  накопления полезных веществ было стимулировано  рядом антибиотиков и налаживанием их промышленного производства. При  промышленном производстве антибиотиков стоимость продукции зависит  от продуктивности штаммов микробов - продуцентов антибиотиков, используемых в производстве.