Генетика микроорганизмов

Генетика микроорганизмов

План

1. Размножение бактерий
2. Генетический аппарат прокариот
3. Наследственность и изменчивость. Виды изменчивости. Генетические рекомбинации микроорганизмов.
4. Методы генетического конструирования микроорганизмов.
5. Получение и выделение мутантов микроорганизмов
6. Понятие о ступенчатом отборе продуцентов. Методы отбора продуцентов при генетическом конструировании

1. Некоторые бактерии не имеют полового процесса и размножаются лишь равновеликим бинарным поперечным делением или почкованием. Для одной группы одноклеточных цианобактерий описано множественное деление (ряд быстрых последовательных бинарных делений, приводящий к образованию от 4 до 1024 новых клеток). Для обеспечения необходимой для эволюции и приспособления к изменчивой окружающей среде пластичности генотипа у них существуют иные механизмы.

При делении большинство грамположительных бактерий и нитчатых цианобактерий синтезируют поперечную перегородку от периферии к центру при участии мезосом. Грамотрицательные бактерии делятся путём перетяжки: на месте деления обнаруживается постепенно увеличивающееся искривление ЦПМ и клеточной стенки внутрь. При почковании на одном из полюсов материнской клетки формируется и растёт почка, материнская клетка проявляет признаки старения и обычно не может дать более 4 дочерних. Почкование имеется у разных групп бактерий и, предположительно, возникало несколько раз в процессе эволюции.

У бактерий наблюдается и половое  размножение, но в самой примитивной  форме.

2. Гены, необходимые для жизнедеятельности и определяющие видовую специфичность, расположены у бактерий чаще всего в единственной ковалентно замкнутой молекуле ДНК — хромосоме (иногда для обозначения бактериальных хромосом, чтобы подчеркнуть их отличия от эукариотических, используют термин генофор (англ. genophore)). Область, где локализована хромосома, называется нуклеоид и не окружена мембраной. В связи с этим новосинтезированная мРНК сразу доступна для связывания с рибосомами, а транскрипция и трансляция сопряжены.

Отдельная клетка может содержать  лишь 80 % от суммы генов, имеющихся во всех штаммах её вида (т. н. «коллективный геном»).

Помимо хромосомы, в клетках  бактерий часто находятся плазмиды — также замкнутые в кольцо ДНК, способные к независимой репликации. Они могут быть настолько велики, что становятся неотличимы от хромосомы, но содержат дополнительные гены, необходимые лишь в специфических условиях. Специальные механизмы распределения обеспечивают сохранение плазмиды в дочерних клетках так что они теряются с частотой менее 10⁻⁷ в пересчёте на клеточный цикл. Специфичность плазмид может быть весьма разнообразной: от одного вида-хозяина до плазмиды RP4, встречающейся почти у всех грамотрицательных бактерий. В них кодируются механизмы устойчивости к антибиотикам, разрушения специфических веществ и т. д., nif-гены, необходимые для азотфиксации также находятся в плазмидах. Ген плазмиды может включаться в хромосому с частотой около 10⁻⁴ — 10⁻⁷. Потеря клеткой плазмиды не приводит к ее гибели. В одной и той же клетке могут находиться разные плазмиды.

В ДНК бактерий, как и в ДНК  других организмов, выделяются транспозоны — мобильные сегменты, способные перемещаться из одной части хромосомы к другой, или во внехромосомные ДНК (в том числе в другие клетки). В отличие от плазмид, они неспособны к автономной репликации, и содержат IS-сегменты — участки, которые кодируют свой перенос внутри клетки. IS-сегмент может выступать в роли отдельной транспозоны.

3. Микроорганизмы обладают способностью изменять свои основные признаки: морфологические (строение); культуральные (рост на питательных средах); биохимические или ферментативные признаки (добавление определенных веществ в питательную среду может вызвать активацию фермента, который до этого находится в латентном состоянии); биологические свойства — может меняться степень патогенности, на этом основаны способы приготовления живых вакцин.

Наследственность — это способность  организмов сохранять определенные признаки на протяжении многих поколений.

Изменчивость — это приобретение признаков под влиянием различных  факторов, отличающих их от предыдущих поколений.

Формы изменчивости микроорганизмов.

Изменения и их форма  в мире микроорганизмов могут  быть разными и зависят от многих причин. Фенотипические изменения связаны с условиями среды, не наследуются, хотя и могут сохраняться длительное время. Генотипические изменения наследуются.

Фенотипические  изменения.

К фенотипическим изменениям относят адаптацию и модификацию.

Адаптация — приспособление микроорганизмов к условиям среды.  
В настоящее время это явление объясняется не изменением в микробной клетке, а развитием ранее измененных особей и гибелью неприспособленных, что установлено при действии на микробы антибиотиков. Приспособленные клетки размножаются, а остальные — погибают, т. е. происходит естественный отбор. 
 Модификация — изменение микроорганизмов под влиянием условий среды. Изменяются только фенотипические (внешние) признаки (форма, размеры, цвет колоний). Так, добавление в среду хлорида кальция приводит к укорочению клеток кишечной палочки. Если из среды удалить это вещество, они вновь принимают исходную форму. Добавление в среду глицерина и аланина вызывает полиморфизм у холерного вибриона. Модификация наблюдается в нормальных условиях жизни, это реакция на внешние раздражения, не связанные с нарушением физиологических процессов в организме. При длительных и сильных воздействиях на микробную клетку могут быть и более глубокие изменения: палочки принимают округлую форму и даже проходят через пористые фильтры.

Генотипические  изменения.

Мутации - наследуемые изменения в последовательности отдельных нуклеотидов, которые приводят к появлению микробов с новыми свойствами. Такой ген кодирует белок, отличающийся от исходного по свойствам и функциям.

Термин мутация введен голландским  ученым Хуго де Фризом, 1901) свойственны  всем живым существам, в том числе  и микроорганизмам.  
 Спонтанные мутации (без направленного воздействия) очень редки: примерно одна на 100 тыс. Они характеризуются изменением какого-нибудь одного признака и обычно стабильны.

Индуцированные, или мутагенные, мутации  возникают вследствие воздействия  факторов среды. Они встречаются  сравнительно часто. Мутагены подразделяются на физические, химические и биологические. К физическим относят различного рода излучения: ультрафиолетовые, рентгеновские, радиоактивные. Они вызывают повреждение генетического аппарата, изменение признаков, свойств микробов; к химическим — сильнодействующие вещества: отравляющие (иприт), лекарственные (йод, пероксид водорода), кислоты (азотистая) и др. Примером биологических мутагенов может быть ДНК. Так, при введении в клетки эмбриона дрозофилы некоторых видов онковирусов взрослые особи приобретают новые признаки: на голове возникают необычные выросты или углубления, иногда исчезают глаза. Отрезок вирусной ДНК, который встраивается в одну из хромосом дрозофилы, вызывает дифференцирование клеток, и, как результат, появляются морфологические и другие изменения.

Существуют крупные и мелкие (точечные) мутации. К крупным относятся мутации, которые характеризуются выпадением большого участка гена. Точечная мутация происходит внутри гена и представляет собой замену, вставку (дупликация), выпадение (делеция) одной пары азотистых оснований ДНК. В результате точечных мутаций происходит наследственное изменение каких-либо свойств микробной клетки, которая, как правило, остается жизнеспособной.

Доказано мутагенное действие вирусов  и живых вирусных вакцин на млекопитающих. Они повреждают наследственный аппарат  не только соматических, но и половых клеток. Мутагенное действие вирусов особенно активно проявляется во время эпизоотии и эпидемий. Численность мутаций возрастает также при нарушении метаболизма и старении организма.

Для получения полезных признаков  у микроорганизмов применяют самые различные мутагены. Таким методом выделены высокоактивные штаммы продуцентов антибиотиков и других веществ. После облучения продуцента пенициллина получены штаммы, которые по своей активности в десятки-сотни раз превосходят исходные. В сочетании с другими факторами и при создании оптимальных условий роста биосинтез повышался: пенициллина в 10 тыс. раз, витамина В₂ (рибофлавина) в 20 тыс., витамина B₁₂ (цианкобаламина) в 50 тыс. раз.

Необходимо отметить, что после  мутагенеза появляются не только полезные, но и вредные признаки. Микробов с полезными признаками бывает очень мало, а самое главное — для их определения приходится проделывать огромную работу: не только выделять тысячи штаммов в чистую культуру, но и изучать их свойства. Так, длительным и кропотливым трудом удалось во много раз повысить выход незаменимых аминокислот (лизин, глутаминовая). Действие радиоактивных веществ вызывает глубокие изменения в генетическом аппарате, но среди микробов появляются расы, устойчивые к ним.

Комбинативные изменения. Также затрагивают генетический аппарат.

Фактически являются проявлением  полового процесса бактерий.

Половое размножение бактерий отличается от полового размножения эукариот тем, что у бактерий не образуются гаметы и не происходит слияния клеток. Однако главнейшее событие полового размножения, а именно обмен генетическим материалом, происходит и в этом случае. Этот процесс называется генетической рекомбинацией. Часть ДНК (очень редко вся ДНК) клетки-донора переносится в клетку-реципиент, ДНК которой генетически отличается от ДНК донора. При этом перенесённая ДНК замещает часть ДНК реципиента. В процессе замещения ДНК участвуют ферменты, расщепляющие и вновь соединяющие цепи ДНК. При этом образуется ДНК, которая содержит гены обеих родительских клеток. Такую ДНК называют рекомбинантной. У потомства или рекомбинантов, наблюдается заметное разнообразие признаков, вызванное смещением генов. Такое разнообразие признаков очень важно для эволюции и является главным преимуществом полового размножения. Известны 3 способа получения рекомбинантов. Это — в порядке их открытия — трансформация, конъюгация и трансдукция. 
 Трансформация — это процесс переноса участка генетического материала ДНК, содержащего одну пару нуклеотидов, от клетки-донора к клетке-реципиенту. Впервые это явление установлено в 1928 г. английским микробиологом Ф Гриффитом. Процесс трансформации может самопроизвольно происходить в природе у некоторых видов бактерий, чаще грамположительных, когда ДНК из погибших клеток захватывается реципиентными клетками. Клетки, способные воспринимать ДНК другой клетки, называются компетентными. Состояние компетентности часто совпадает с логарифмической фазой роста.

В процессе трансформации различают  пять стадий: первая - адсорбция трансформирующей ДНК на поверхности микробной клетки; вторая - проникновение ДНК в клетку-реципиент; третья - спаривание внедрившейся ДНК с хромосомными структурами клетки; четвертая - включение участка ДНК клетки-донора в хромосомные структуры клетки-реципиента; пятая - дальнейшее изменение нуклеотида в ходе последующих делений.

Трансформироваться могут устойчивость и чувствительность к антибиотикам, способность к синтезу ферментов  и т. д. Трансформация признаков  ДНК происходит только при определенных условиях и физиологических состояниях клетки, получивших название «состояние готовности». Оптимальная температура трансформации 29-32°С. Высокая температура (80-100°С), химические вещества (азотистая кислота), ультрафиолетовые излучения, фермент ДНК-аза приостанавливают трансформирующее действие ДНК.

В настоящее время трансформация является основным методическим приемом в генной инженерии, используемым при конструировании рекомбинантных штаммов с заданным геномом. Для трансформации необходимо создавать особые условия, например, добавляя неорганические фосфаты, повышается частота трансформации.

Конъюгация - передача генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиент при непосредственном половом контакте клеток. Необходимым условием конъюгации является наличие в клетке-доноре трансмиссивной F-плазмиды (фертильности, плодовитости). Эта плазмида способна передаваться от донора к реципиенту, она кодирует синтез половых пилей, образующих конъюгационный мостик между клеткой-донором и клеткой-реципиентом, по которому происходит передача плазмидной и клеточной ДНК. В результате такого переноса клетка-реципиент получает донорские свойства. Клетки, играющие роль донора, обозначают F⁺, а реципиенты — F^-. F-фактор находится в цитоплазме клеток, причем он не один. При конъюгации происходит перенос только ДНК без РНК и белка.

Трансдукция - передача бактериальной ДНК посредством бактериофага. В процессе репликации фага внутри бактерий фрагмент бактериальной ДНК проникает в фаговую частицу и переносится в бактерию-реципиент во время фаговой инфекции.

Существуют два типа трансдукции: общая и специфическая. Общая трансдукция (неспецифическая) - перенос бактериофагом фрагмента любой части бактериальной хромосомы. Специфическая трансдукция - перенос в клетку-реципиент строго определенного участка бактериальной ДНК донора.  Практическое значение изменчивости: с помощью генетических методов получены специальные культуры дрожжей и других микробов, используемые в технологии изготовления пищевых продуктов, производстве анатоксинов, вакцин, антибиотиков, витаминов;

 * большое научное и практическое значение имеет генная инженерия, методы которой позволяют изменять структуру генов и включать в хромосому бактерий гены других организмов, ответственных за синтез важных и нужных веществ, которые получить химическим путем очень трудно, — инсулин, интерферон и др.;