Генетика микроорганизмов

ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Особенности генетики микроорганизмов

Генетика – это наука о наследственности и наследуемой и ненаследуемой изменчивости.

В настоящее время генетика является подлинным фундаментом для молекулярной и клеточной биологии. В свою очередь, результаты исследований в области генетики микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов и простейших) оказались весьма важными для выяснения всех основных генетических закономерностей и принципов.

Это связано с тем, что изучение структуры и функции генетического материала, который может самовоспроизводиться, подвергаться изменениям и проявляться самыми разными способами, является чрезвычайно сложной задачей. Поэтому более простой по устройству организм является и наиболее удобной моделью для изучения этих процессов. Впоследствии было выявлено, что механизмы наследования признаков у высших организмов и бактерий имеют очень много общего. Бактерии и вирусы (в том числе вирусы бактерий – бактериофаги) оказались наиболее подходящими объектами для изучения природы генетического материала, его организации и функционирования.

Это было обусловлено следующими преимуществами работы с микроорганизмами:

1.   Гаплоидное строение генома, т.е. у бактерий имеется лишь одна хромосома-нуклеоид, что позволяет оценить генетические изменения уже в первом поколении бактериальных клеток.

2.   Высокая скорость размножения.

3.   Относительно простое строение (особенно у вирусов).

4.   Удобство культивирования с возможностью быстрого изменения внешних условий.

5.   Высокая разрешающая способность генетического анализа микроорганизмов с обнаружением мутаций, возникающих с частотой 10-9 и менее.

6.   Способность к комбинативной и мутационной изменчивости.

Наиболее интенсивно изучаемый вид в генетике микроорганизмов – это нормальный обитатель кишечника человека Escherchia coli. Данная бактерия легко культивируется в жидкой питательной среде, содержащей некоторые соли и простой источник углерода, например глюкозу. Из этих соединений Е.coli способна синтезировать все сложные органические молекулы, образующие клетку. За сутки культивирования популяция, возникшая из одной-единственной клетки Е.coli, может достигнуть 2-3*109 бактерий на 1 мл среды.

Полученную культуру засевают на чашку Петри с питательной средой. После инкубации бактерии начинают быстро делиться и дают на агаре колонии, которые являются потомками единственной микробной клетки. Отсюда можно получить чистую культуру любой мутантной бактерии, присутствовавшей в исходной бактериальной взвеси.

Помимо экспериментов на бактериях, существенный вклад в генетику внесли исследования с помощью бактериофагов – вирусов бактерий. Заражая фагом (в том числе – и с измененным геномом) чувствительную культуру микроорганизмов, можно получить большую популяцию фаговых частиц. После инкубации бактерии, размножаясь, образуют на агаре сплошной газон клеток. В местах, инфицированных бактериофагом, образуются негативные колонии или бляшки. При определенных условиях каждая негативная колония на бактериальном газоне содержит потомство одной индивидуальной частицы фага. Тем самым осуществляется накопление генетического материала фага для его последующего изучения.

Использование микробиологических систем привело к выдающимся открытиям в генетике.

На бактериях впервые была установлена химическая природа наследственного материала и заложен фундамент молекулярной генетики (О. Эвери, К. Мак-Леод, М. Мак-Карти, 1944)

На бактериях и фагах решена проблема генетического кода (Дж. Уотсон, Ф. Крик, 1953)

Доказан полуконсервативный способ репликации ДНК (М. Мезелсон, Ф. Сталь, 1958).

Изучена тонкая структура гена (С. Бензер, 1955)

Установлен механизм мутаций и рекомбинаций.

Разработана концепция оперона как модели организации генов в хромосоме (Ф. Жакоб, Ж. Моно, 1961)

Выявлено наличие информационной (матричной) РНК. Она впервые была обнаружена в 1961 г. Ф.Жакобом и Ж.Моно у бактерий, зараженных фагом, а позднее у высших организмов.

Исследования в области генетики микроорганизмов привели к созданию важнейшей прикладной отрасли современной генетики – генной инженерии.

5.2. Организация генетического аппарата микроорганизмов

Генетический материал бактериальных клеток представлен двойной спиралью ДНК, состоящей из 2-х комплементарных полинуклеотидных цепочек, в каждой из которых пуриновые и пиримидиновые основания распределены вдоль остова, построенного из меняющихся фосфатных групп и дезоксирибозы; 2 цепочки удерживаются друг с другом посредством водородных связей между соответствующими основаниями.

У вирусов генетический материал представлен лишь одним типом нуклеиновой кислоты – либо ДНК, либо РНК. Подробно химическая структура нуклеиновых кислот, являющихся основой наследственности, изложена в курсе биохимии.

Клетки бактерий могут содержать несколько генетических элементов, способных к репликации. По предложению Ф.Жакоба, С.Бреннера и Ф.Кузина структура бактериальной клетки, способная к самовоспроизведению, получила название «репликон».

Репликоны бактерий представлены бактериальной хромосомой (нуклеоидом), плазмидами и эписомами. Плазмиды представляют собой репликон, находящийся в автономном состоянии в цитоплазме бактериальной клетки, эписомы могут находиться как в свободном состоянии, так и быть интегрированными в нуклеоид, составляя с ним общий репликон.

Нуклеоид представляет собой замкнутую кольцевидную хромосому бактерий, свободно располагающуюся в цитоплазме, и содержит несколько тысяч отдельных генов. В зависимости от стадии жизненного цикла в бактериальной клетке обычно присутствуют от одного до четырех копий нуклеоида. Длина бактериальной хромосомы в развернутом состоянии составляет приблизительно 1 мм.

Существуют два основных способа репликации ДНК нуклеоида. По первому типу репликация кольцевидной молекулы ДНК начинается от начальной точки ori (origin – начало) в определенном месте ее кольца. Сначала идет раскручивание (деспирализация) двойной цепи ДНК, в результате чего образуется репликативная вилка. Одна из цепей, достраиваясь, связывает нуклеотиды от 5`- к 3`-концу, другая достраивается посегментно.

Данный способ репликации ДНК проходит через промежуточную структуру, напоминающую греческую букву тэта. Тэта-тип репликации приводит к образованию двух дочерних кольцевых хромосом. В них сохраняется одна из цепей исходной молекулы ДНК, а вторая цепь синтезируется из нуклеотидов ДНК-полимеразами.

Превращение кольцевой бактериальной хромосомы в линейную происходит при другом типе репликации нуклеоида – по так называемому «сигма-типу» или иначе – по механизму «катящегося кольца». Этот механизм осуществляется через промежуточную структуру, напоминающую греческую букву «сигма». Он реализуется во время конъюгации бактерий, а также у некоторых фагов. В этом случае первоначально образуется разрыв в одной из цепей ДНК кольцевой молекулы, и разорвавшаяся цепь ДНК начинает сдвигаться с комплементарной кольцевой цепи. При этом происходит одновременное достраивание до двухцепочечной ДНК как сдвигающейся линейной цепи, так и остающейся кольцевой.

Третий известный тип репликации ДНК характерен для линейных молекул ДНК. Он присущ всем эукариотическим организмам, а также некоторым вирусам. В этом случае в ДНК появляется вздутие – точка инициации. Далее вздутие распространяется в обоих направлениях с одновременным удвоением родительской ДНК.

Единицей наследственности у всех живых организмов являются гены. Они в ДНК лежат дискретно и линейно (колинеарно). Гены способны создавать собственную копию, т.е. способны к саморепликации. Последовательность аминокислот в синтезируемом белке определяется последовательностью нуклеотидов в гене.

Генотип микроорганизма – это полная совокупность генов данной особи. Однако реализуется генотип только через его взаимодействие с окружающей средой. Условия среды способствуют проявлению (экспрессии) генов или подавляют их функциональную активность. Тем самым создается фенотип микроорганизма – набор его свойств и признаков (морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и т.д.)

Гены, ответственные за синтез определенного соединения у бактерий, обозначают строчными буквами латинского алфавита со знаком «+». Например, gal+ – ген, ответственный за потребление сахара галактозы, bio+ – за синтез витамина Н (биотина) и т.д. Гены, контролирующие устойчивость к лекарственным средствам, химическим соединениям, обозначают буквой r (resistent – устойчивый). Например, резистентность к стрептомицину обозначается как strr, а чувствительность strs. Фенотип бактерий обозначают так же, как и генотип, но с прописной буквы.

Согласно схеме, предложенной Жакобом и Моно, гены можно подразделить следующим образом:

Структурные гены – они обусловливают синтез определенных белков-ферментов, участвующих в биохимических реакциях.

Гены-регуляторы – определяют синтез белковых веществ (часто это репрессоры), имеющих высокое сродство к ДНК в области гена-оператора и изменяющих деятельность структурных генов.

3. Гены-промоторы (или промоторная область) – участок ДНК распознаваемый ДНК-зависимой РНК-полимеразой, необходимый для начала транскрипции

4. Гены-операторы – посредники, располагающиеся между структурными генами, промотором и генами-регуляторами. Если в среде появляется вещество-индуктор, которое связывает репрессор, то снимается блок со структурных генов и они начинают функционировать.

Совместно ген-регулятор, промотор, onepaтop и структурные гены образуют оперон.

Оперон является функциональной генетической единицей, ответственной за экспрессию одного или группы генов.

Существуют индуцибельные и репрессибельные опероны. Типичным примером индуцибельного оперона является Lac-оперон, его гены контролируют синтез ферментов, обеспечивающих утилизацию лактозы в микробной клетке. Если клетка не нуждается в лактозе, то активный белок-репрессор, кодируемый геном-регулятором, связан с областью оператора и блокирует транскрипцию, поддерживая оперон в неактивном состоянии. Индуктор (углевод) поступает в клетку, далее происходит его связывание с белком-репрессором и вытеснение репрессора с ДНК. Снятие репрессии приводит к активации структурных генов оперона и началу процесса транскрипции с последующей трансляцией. Образующиеся ферменты (в частности – галактозидаза) утилизируют поступающую лактозу. При снижении ее концентрации в клетке ферменты начинают расщеплять индуктор. Тем самым происходит освобождение репрессора, что приводит к торможению активности структурных генов.

Примером репрессибельного оперона является триптофановый оперон, обеспечивающий синтез аминокислоты триптофана. Обычно этот оперон функционирует постоянно, а его белок-репрессор находится в неактивном состоянии. При возникновении избытка триптофана в среде аминокислота связывается с репрессором и активирует его. Активный репрессор «выключает» работающий оперон.

5.3. Внехромосомные факторы наследственности

(плазмиды и эписомы)

Внехромосомные факторы наследственности бактерий представлены плазмидами и эписомами. Эти генетические структуры представлены ДНК, которая способна самостоятельно реплицироваться. Они находятся в цитоплазме клетки. Одни из них располагаются автономно и не могут встраиваться в нуклеоид бактерии (собственно плазмиды), другие обладают такой способностью (эписомы).

Они были исследованы Д. Ледербергом, Ф. Жакобом и Э. Вольманом, которые подчеркнули, что ДНК плазмид осуществляет генетическую функцию независимо от ДНК нуклеоида.

Основные свойства плазмид следующие:

1. ДНК в них имеет кольцевую структуру.

2. Наличие плазмид не обязательно в клетке, но если они есть, то они обеспечивают новые свойства клетке (способность к конъюгации, устойчивость к антибиотикам и т.д.)

3. В одной клетке может быть несколько плазмид. Если они сходны по структуре (F-фактор, Col-фактор), то одна из этих плазмид может элиминироваться. Неродственные плазмиды «совместимы», т.к. системы их репликации совершенно различны и не мешают друг другу.

По способности передаваться из одной клетки в другую плазмиды делятся на конъюгативные – трансмиссивные и неконъюгативные – нетрансмиссивные.

Конъюгативные плазмиды обеспечивают процесс конъюгации и придают клетке свойства генетического донора. В процессе конъюгации они могут превращать генетического реципиента в генетического донора. Конъюгативные плазмиды способствуют синтезу на поверхности клеток специфических ворсинок для контакта с реципиентной клеткой. Конъюгативные плазмиды содержат tra-оперон (англ. transfer – перенос) который детерминирует способность клетки передавать плазмиду от клетки донора к клетке реципиента.

Неконъюгативные плазмиды не придают клетке свойств генетического донора, не передаются в клетку реципиента самостоятельно, не имеют tra-оперона. Для их переноса в другую клетку необходимо наличие в клетке хозяина других факторов передачи, например умеренного бактериофага.

Виды плазмид:

F-фактор – фактор фертильности.

Col-фактор – колициногенный фактор – фактор бактериоциногении.