G белки

Структура и свойства

 

1. G-белки - гетеротримеры, в которых α-субъединица непрочно связана с димером β-γ.

2. Все известные α-субъединицы (мол. масса – 50кДа) гомологичны, и у большинства из них одинаковые (или очень сходные) b-субъединицы (мол. масса З5кДа) и γ-субъединицы (мол. масса 8кДа).

З. α-субъединица определяет специфичность  связывания G-белка с рецептором и эффектором, уникальна для каждого G-белка.

4. α-субъединица связывает и  гидролизует ГТФ (ГТФ-аза).

5. α-субъединица содержит высоко  консервативный домен связывания  и гидролиза ГТФ (18 аминокислот  из 350-395).

6. Выявлены участки связывания  гуаниновых нуклеотидов и участки взаимодействия с рецепторами (С-конец) и βγ-димерами (N-конец).

7. Выявлены участки АDР-рибозилирования (аргинин-202) при действии холерного токсина и коклюшного токсина.

Связь с мембраной

 

G-белки локализованы на внутренней поверхности плазматической мембраны. Первичная структура всех субъединиц G-белков не содержит гидрофобных, пронизывающих мембрану доменов.

1. Ассоциации G-белков с мембраной содействует ацилирование жирнокислотными радикалами. Выявлено два типа липидных модификаций субъединиц G-белков: миристоилирование и изопренилирование белковой цепи.

2. Показано для α-субъединиц Go - и Gi-белков посттрансляционное миристоилирование со стороны N-конца.

З. Для βγ-субъединиц также показаны посттрансляционные модификации (ацилирование).

4. Выявлены три последовательные  посттрансляционные модификации, ответственные за связывание ras-белков с мембраной.

5. Очищенные α-субъединицы проявляют гидрофильные свойства (без βγ - комплекса не могут связываться с искусственными фосфолипидными пузырьками).

Стуктурно-функциональная организация  G-белков

 

G-белки (ГТФ-связывающие белки) - универсальные посредники при передаче сигналов от рецепторов к ферментам клеточной мембраны, катализирующим образование вторичных посредников гормонального сигнала. G-белки - олигомеры, состоящие из α, β и γ-субъединиц. Состав димеров βγ незначительно различаются в разных тканях, но в пределах одной клетки все G-белки, как правило, имеют одинаковый комплект βγ-субъединиц. Поэтому G-белки принято различать по их α-субъединицам. Выявлено 16 генов, кодирующих различные α-субъединицы G-белков. Некоторые из генов имеют более одного белка, вследствие альтернативного сплайсинга РНК.

Каждая а-субъединица в составе G-белка имеет специфические центры:

связывания ГТФ или ГДФ;

взаимодействия с рецептором;

связывания с βγ-субъединицами;

фосфорилирования под действием протеинкиназы С;

взаимодействия с ферментом  аденилатциклазой или фосфолипазой С.

В структуре G-белков отсутствуют α-спиральные, пронизывающие мембрану домены. G-белки относят к группе "заякоренных" белков.

Сопряжение с эффекторными системами

 

ГТФ-связываюшие белки управляют несколькими мембранными ферментами и рядом ионных каналов.

Вероятно с G-белками взаимодействует цитоскелет, благодаря чему гормоны регулируют секрецию и эндоцитоз.

Различают неактивную форму G-белка - комплекс αβγ-ГДФ и активированную форму αβγ-ГТФ. Активация G-белка происходит при взаимодействии с комплексом активатор-рецептор, изменение конформации G-белка снижает сродство α-субъединицы к молекуле ГДФ и увеличивает к ГТФ.

Замена ГДФ на ГТФ в активном центре G-белка нарушает комплементарность между α-ГТФ и βγ-субъединицами. Рецептор, связанный с сигнальной молекулой, может активировать большое количество молекул G-белка, таким образом обеспечивая усиление внеклеточного сигнала на этом этапе.

Активированная α-субъединица G-белка (α-ГТФ) взаимодействует со специфическим белком клеточной мембраны и изменяет его активность. Такими белками могут быть ферменты аденилатциклаза, фосфолипаза С, фосфодиэстераза цГМФ, Nа+-каналы, K+-каналы.

Следующий этап цикла функционирования G-белка - дефосфорилирование ГТФ, связанного с α-субъединицей, причём фермент, катализирующий эту реакцию, - сама α-субъединица.

Дефосфорилирование приводит к образованию комплекса α-ГДФ, который не комплиментарен специфическому белку мембраны (например аденилатциклазе), но имеет высокое сродство к βγ-протомерам. G-белок возвращается к неактивной форме - αβγ-ГДФ. При последующей активации рецептора и замене молекулы ГДФ на ГТФ цикл повторяется снова. Таким образом, αβγ-субъединицы G-белков совершают челночное движение, перенося стимулирующий или ингибирующий сигнал от рецептора, который активирован первичным посредником (например, гормоном), на фермент, катализирующий образование вторичного посредника.

Некоторые формы протеинкиназ могут фосфорилировать α-субъединицы G - белков. Фосфорилированная α-субъединица не комплиментарна специфическому белку мембраны, например аденилатциклазе или фосфолипазе С, поэтому не может участвовать в передаче сигнала.

Фосфолипазы

 

Фосфолипазы - ферменты класса гидролаз, катализирующие катаболизм глицерофосфолипидов. Различают фосфолипазы секреторные, входящие в состав панкреатического сока, и клеточные фосфолипазы. Клеточные фосфолипазы А1, А2, D, С различаются по специфичности к отщепляемой группе. Все фосфолипазы - кальций зависимые ферменты.

Фосфолипаза С - фермент, гидролизующий фосфоэфирную связь в глицерофосфолипидах. В клетках человека идентифицировано 10 изоформ фосфолилазы С, различающихся по молекулярной массе, локализации, способу регуляции, субстратной специфичности. В структуре всех изоформ фосфолипазы С отсутствуют гидрофобные домены, которые могли бы обеспечить их взаимодействие с мембраной. Однако некоторые формы фосфолипазы С связаны с мембраной с помощью гидрофобного "якоря" - ацильного остатка миристиновой кислоты или за счёт взаимодействия с поверхностью бислоя. Каталитическая активность всех изоформ фосфолипазы С зависит от ионов кальция.

Большинство фосфолипаз С специфично в отношении фосфатидилинозитолов и практически не гидролизует другие типы фосфолипидов. Активный фермент может гидролизовать до 50% от общего количества фосфатидилинозитолов клеточной мембраны. При гидролизе фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (ФИФ2) образуются гидродугты диацилглицерол (ДАГ) и инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ3), служащие вторичными посредниками в трансмембранной передаче сигнала по инозитолфосфатному пути.

Инозитолфосфатная система

 

Функционирование инозитолфосфатной системы трансмембранной передачи сигнала обеспечивают: R (рецептор), фосфолипаза С, Gрlс - белок, активирующий фосфолипазу С, белки и ферменты мембран и цитозоля.

Последовательность событий, приводящих к активации фосфолипазы С:

связывание сигнальной молекулы, например гормона с рецептором (R) вызывает изменение конформации и увеличение сродства к Gplc-белку.

образование комплекса [Г] [R] [Gрlс ГДФ] приводит к снижению сродства α-протомера G рlс белка к ГДФ и увеличению сродства к ГТФ. ГДФ заменяется на ГТФ.

это вызывает диссоциацию комплекса; отделившаяся α-субъединица, связанная с молекулой ГТФ, приобретает сродство к фосфолипазе С.

α-ГТФ взаимодействует с фосфолипазой С и активирует её. Под действием фосфолипазы С происходит гидролиз липида мембраны фосфатидилинозитол-4,5 - биофосфата (ФИФ2).

в ходе гидролиза образуется и выходит  в цитозоль гидрофильное вещество инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ3). Другой продукт реакции диацилглицерол (ДАГ) остаётся в мембране и участвует в активации фермента протеинкиназы С (ПКС).

инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ3) связывается  специфическими центрами Са2 - канала мембраны ЭР, это приводит к изменению конформации белка и открытию канала - СаІ+ поступает в цитозоль. В отсутствие в цитозоле ИФ3 канал закрыт.

Активация протеинкиназы С.

• Повышение концентрации СаІ+ в цитозоле клетки увеличивает скорость

взаимодействия СаІ+ с неактивным цитозольным ферментом протеинкиназой С(ПКС) и белком кальмодулином, таким образом сигнал, принятый рецептором клетки, раздваивается.

• Связывание протеинкиназы С с ионами кальция позволяет ферменту вступать в кальций-опосредованное взаимодействие с молекулами "кислого" фосфолипида мембраны, фосфатидилсерина (ФС). Диацилглицерол, занимая специфические центры в протеинкиназе С, ещё более увеличивает её сродство к ионам кальция.

• На внутренней стороне мембраны образуется ферментативный комплекс - [ПКС] [СаІ+] [ДАГ] [ФС] - активная протеинкиназа С, фосфорилирующая специфические ферменты по серину и треонину.

Участие белка кальмодулина в инозитолфосфатной  передаче сигнала

 

В клетках многих тканей присутствует белок кальмодулин, который функционирует как внутриклеточный рецептор СаІ+, он имеет 4 центра для связывания СаІ+. Комплекс [кальмодулин] - [4СаІ+] не обладает ферментативной активностью, но взаимодействие комплекса с различными белками и ферментами приводит к их активации.

 
Саморегуляция системы

 

Как и большинство систем трансмембранной  передачи сигналов, инозитолфосфатная система имеет не только механизм усиления, но и механизм подавления сигнала. Присутствующие в цитозоле инозитол-1,4,5-трифосфат ((ИФ3) и диацилглицерол (ДАГ) в мембране могут в результате серии реакций опять превращаться в фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (ФИФ2). Ферменты, катализирующие восстановление фосфолипида, активируются фосфорилированием протеинкиназой С.

Концентрация СаІ+ в клетке снижается до исходного уровня при действии СаІ+-АТФ-аз цитоплазматической мембраны и ЭР, а также Na+/СаІ+-и Н+/СаІ+-транслоказ (активный антипорт) клеточной и митохондриальной мембран.

Функционирование транслоказ СаІ+ и СаІ+-АТФ-аз может активироваться:

комплексом [камьмодулин] [4 Са] ;

протеинкиназой А (фосфорилированием);

протеинкиназой С (фосфорилированием). Понижение концентрации Са2 в клетке и диацилглицерола в мембране приводит к изменению конформации протеинкиiiазы С, снижению её сродства к фосфатидилсерину, фермеiтт диссоциирует в цитозоль (неактивная форма).

Фосфорилированные протеинкиназой С ферменты и белки под действием фосфопротеинфосфатазы переходят в дефосфорилированную форму.

α-субъединица: общие свойства

 

α-субъединица играет главную роль в функционировании G-белков. Она связывает ГТФ. Она обратимо взаимодействует с β и γ субъединицами, присоединяясь к ним, когда в центре находится ГДФ и диссоциируя, когда в центре ГТФ. При связывании ГТФ α субъединица активируется и приобретает способность регулировать эффекторные системы внутриклеточные. α субъединицы части G-белков могут подвергаться химическим модификациям. Под воздействием холерного и коклюшного токсинов происходит ФДФ-риболизирование белков по аргининовому и цистеиновому остатку на С-конце, в результате чего нарушается нормальное функционирование G-белков.

Кроме того, протеинкиназа С может фосфорилировать α-субъединицу очищенного G-белка, а in vivо белка Gz. По-видимому белки при этом инактивируются.

Большинство G-белков имеет α-субъединицы с молекулярным весом около 40 Кд.

β и γ субъединицы: общая характеристика

 

Бета и гамма субъединицы  образуют комплекс друг с другом, распадающийся  только в денатурирующих условиях. До конца их роль не ясна. В экспериментах  с трансдуцином, а затем с белком Gi было показано, что субъединицы бета и гамма необходимы для взаимодействия G-белка с рецептором и замещения ГДФ на ГТФ.

Бета-гамма комплекс прочно связан с мембраной и служит якорем для  α-субъединицы. При отделении α-субъединицы бета-гамма комплекс может переходить в цитоплазму.

Кроме связывания и ингибирования  активности α-субъединицы бета - гамма комплекс в некоторых случаях оказывает прямое воздействие на эффекторные системы клетки. Он активирует фосфолипазу А2, взаимодействует с кальмодулином благодаря чему ингибирует активность аденилатциклазы мозга. G-бета-гамма комплекс ингибирует стимуляцию

АС1 по средством Gs-альфа.

АС2 стимулируется связыванием G-бета-гамма, но только в присутствии Gs - альфа.

АС3 также стимулируется G-бета-гамма. Калиевые каналы сердца открываются при связывании Gs-альфа и G-бета-гамма. Мембрана клеточная: стимуляция гидролиза фосфолипидов. Мембрана клеточная: изменение содержания цАМФ.

G-белки: βγ-субъединицы

 

Фосфорилирование рецепторов является одним из механизмов регуляции их активности. βγ-субъединицы G-белков могут осуществлять отрицательную обратную связь, активируя протеинкиназы, которые фосфорилируют рецепторы. Эти протеинкиназы называются GRК. К GRК протеинкиназам относятся родопсинкиназа и β-адренергическая киназа. Фосфорилирование приводит к удалению рецептора киназа. Например, мускариновые и адренорецепторы, фосфорилированные по серину и треонину на С-концевом домене, становятся мишенью для связывания арристина, что подготавливает их для удаления эндоцитозом. Обычно на С-конце рецептора есть несколько участков для фосфорилирования различными протеинкиназами. Известно, что слабый стимул (низкая концентрация агониста) активирует протеинкиназу А, а сильный стимул активирует b-АRК протеинкиназу, которая, фосфорилируя рецептор, прерывает передачу сигнала на аденилатциклазу и прекращает производство сАМР. Фосфорилирование, осуществляемое протеинкиназой А происходит тогда, когда занято 10% рецепторов. При этом фосфорилирование уже других, не занятых, рецепторов приводит к освобождению βγ-субъединиц и соответствующему фосфорилированию другой протеинкиназой b-АRК.

βγ-субъединицьт обеспечивают локализацию, эффективное связывание и дезактивацию α-субъединиц, регулируют сродство рецепторов к их активирующим лигандам, понижают способность GDР к диссоциации от субъединицы (стабилизация инактивированного состояния), открывает мускариновый К+-канал в сердце, закрывают Са2+ - канал в пресинаптической мембране, активируют фосфолипазу РLА2 и некоторые изоформы фосфолипазы С, регулируют сродство рецептора к агонисту.