Біосинтез лікопіну

ТП 4.4 Вирощування посівного матеріалу ІІ генерації

ТП 4.2.1 Вирощування (-) штаму. Компоненти поживного середовища надходять від  ДР 3.3.1 та  ДР 3.3.2; тіамін з ДР 3.3. У посівні апарати із розчинами солей стерильно додають цукровмісні компоненти та тіамін. Додають піногасник та охолоджують до температури культивування. Так як культура є аеробом,  в посівний апарат надходить стерильне повітря із ДР 2.8 Посівний матеріал надходить із ТП 4.3.1. Вирощування триває 48 годин. Температура процесу становить 27 ⁰С, кількість обертів мішалки – 200 об/хв. Через кожні 8 годин проводять мікробіологічний контроль на наявність сторонньої мікрофлори. Після завершення процесу визначають вміст біомаси.

ТП 4.2.2 Вирощування (+) штаму. Компоненти поживного середовища надходять від  ДР 3.3.1 та  ДР 3.3.2; тіамін з ДР 3.3. У посівні апарати із розчинами солей стерильно вносять цукровмісні компоненти та тіамін. Додають піногасник та охолоджують до температури культивування. Так як культура є аеробом,  в посівний апарат надходить стерильне повітря із ДР 2.8 Культура надходить із ТП 4.3.2. Вирощування триває 48 годин. Температура процесу становить 27 ⁰С, кількість обертів мішалки – 200 об/хв. Через кожні 8 годин проводять мікробіологічний контроль на наявність сторонньої мікрофлори. Після завершення процесу визначають вміст біомаси.

ТП 5 Виробниче  культивування

До стерильного розчину  солей у ферментері додають розчини цукрів та рослинні олії, які надходять і ДР 3.4.2 та ДР 3.4.3 відповідно. Також додають тіамін із ДР 3.4. Вносять піногасник та доводять до температури культивування. Із ТП 4.3.1 та ТП4.3.2 надходить посівний матеріал. Повітря для аерації подається від ДР 2.8 Виробниче культивування триває 120 годин. Температура процесу на першому етапі становить 32 ⁰С; на другому етапі – 22 ⁰С.   Кількість обертів мішалки – 200 об/хв. Повітря подається зі швидкістю 6 л/хв. рН становить 6,2-6,8. Під час процесу кожні 8 годин проводять мікробіологічний контроль на наявність сторонньої мікрофлори. Після завершення процесу визначають ввміст цільового продукту та біомаси.

 

 

 

 

6.3 Контроль  виробництва

Таблиця 6.2

Карта постадійного контролю                                                          

Номер контрольної  точки та назва стадії	Об’єкт контролю та показник, що визначається	Методи контролю та прилади	Періодичність перевірки  та порядок відбору проб	Нормативна характеристика показника, що визначається
1	2	3	4	5
К1.2.1 Хіміко-технологічний контроль приготування розчину каустичної соди	Концентрація розчину; температура  води, в якій розчиняють.	Фізичні методи визначення концентраціїта температури	Після приготування розчину та під час розчинення	С = 2% , t= 75 0С.
К1.2.2 Хіміко-технологічний контроль приготування розчину хлораміну	Концентрація розчину; температура  розчинника.	Фізичні методи визначення концентрації; термометр	Після приготування розчину  та під час розчинення	С = 2%, t = 40-45 0С.
К1.4.1Технологічний контроль миття обладнання та комунікацій	Температура та час	Термометр, годинник	Під час процесу миття	T = 80 0С, τ = 15-20 хв.
К1.4.3Технологічний контроль перевірки обладнання та комунікацій на герметичність	Тиск,час	Манометр технічний, годинник	Під час процесу	Р = 0,3 МПа, τ = 30 хв.
К1.4.4. Технологічний контроль стерилізації обладнання та комунікацій	Тиск, температура	Термометр, манометр	Під час стерилізації	T = 125-130 0С, Р = 0,2 МПа
К2.2Технологічний контроль очищення повітря від пилу та механічних часток на фільтрах грубої фільтрації	Ступінь очищення	Датчик кількості механічних часточок та пилу	Під час подачі повітря  безперервно	Е = 80%
К2.3Технологічний контроль компремування повітря	Тиск	Манометр технічний	Під час процесу	Р = 0,35 МПа
К2.5 Технологічний контроль стабілізації термодинамічних показників	Температура.	Термометр	Під час процесу	T охолодження = 24-40 0С T нагрівання = 70-90 0С;
К2.7Технологічний та мікробіологічний контроль повітря під час очищення на головному фільтрі	Ступінь очищення, мікробна контамінація	Метод визначення аспіраційний . Фільтри перевіряються 1 раз  на місяць.	Під час виробничого процесу  та після нього	Е = 98%,  КУО < 1.
К2.8 Технологічний  та мікробіологічний контроль під час очищення на індивідуальних фільтрах	Вміст часточок та мікроорганізмів	Аспіраційний  метод визначення сторонньої мікрофлори 1 раз на місяць	Під час  та після завершення виробничого процесу	Е = 99,99% КУО < 1.
К3.1 Хімічно-технологічний  та мікробіалогічний контроль приготування та стерилізації компонентів поживного середовища при вирощуванні на колбах 3.1.1. Приготування та стерилізація  цукровмісних компонентів 3.1.2 Приготування та стерилізація  розчину солей	Маса компонентів поживного середовища, температура, рН, тиск, час стерилізації	Ваги технічні, рН метр, годинник, термометр, манометр.	Маса компонентів перед  приготуванням розчинів; рН перед  стерилізацією час, температура, тиск під час стерилізації. Мікробіологічний контроль шляхом висіву на чашки Петрі	Маса компонентів середовища згідно опису; режим стерилізації для цукровмісних компонентів: Т = 120 0С, τ = 40 хв, Р = 0,05 МПа, КУО <1 рН = 6,2 Для розчину мінеральних  солей: T = 131 0С, Р = 0,15 МПа, τ = 60 хв, КУО < 1.
К 3.2 Хімічно-технологічний та мікробіалогічний контроль приготування та стерилізації компонентів поживного середовища при вирощуванні посівного матеріалу І генерації 3.2.1. Приготування та стерилізація цукровмісних компонентів 3.2.2 Приготування та стерилізація розчину солей	Маса компонентів поживного середовища, температура, рН, тиск, час стерилізації	Ваги технічні, рН метр, годинник, термометр, манометр.	Маса компонентів перед  приготуванням розчинів; рН перед стерилізацією час, температура, тиск під час стерилізації. Мікробіологічний контроль шляхом висіву на чашки Петрі	Маса компонентів середовища згідно опису; режим стерилізації для  цукровмісних компонентів: Т = 112 0С, τ = 30 хв, Р = 0,05 МПа, КУО <1 рН = 6,2 Для розчину мінеральних  солей: T = 131 0С, Р = 0,15 МПа, τ = 60 хв, КУО < 1. рН перед стерилізацією  = 4. Після стерилізації доводять до 6,2
К 3.3 Хімічно-технологічний та мікробіалогічний контроль приготування та стерилізації компонентів поживного середовища при вирощуванні посівного матеріалу ІІ генерації 3.3.1. Приготування та стерилізація цукровмісних компонентів 3.3.2 Приготування та стерилізація розчину солей	Маса компонентів поживного середовища, температура, рН, тиск, час стерилізації	Ваги технічні, рН метр, годинник, термометр, манометр.	Маса компонентів перед  приготуванням розчинів; рН перед  стерилізацією час, температура, тиск під час стерилізації. Мікробіологічний контроль шляхом висіву на чашки Петрі	Маса компонентів середовища згідно опису; режим стерилізації для  цукровмісних компонентів: Т = 112 0С, τ = 30 хв, Р = 0,05 МПа, КУО <1 рН = 6,2 Для розчину мінеральних  солей: T = 131 0С, Р = 0,15 МПа, τ = 60 хв, КУО < 1. рН перед стерилізацією  = 4. Після стерилізації доводять до 6,2
К 3.4 Хімічно-технологічний та мікробіалогічний контроль приготування та стерилізації компонентів поживного середовища для виробничого культивування 3.4.1. Приготування та стерилізація  цукровмісних компонентів 3.4.2Приготування та стерилізація  розчину мінеральних солей 3.4.3Стерилізація соєвої оліі	Маса компонентів поживного середовища, температура, рН, тиск, час стерилізації	Ваги технічні, рН метр, годинник, термометр, манометр.	Маса компонентів перед  приготуванням розчинів; рН перед  стерилізацією час, температура, тиск під час стерилізації. Мікробіологічний контроль шляхом висіву на чашки Петрі.	Маса компонентів середовища згідно опису; режим стерилізації для  цукровмісних компонентів: Т = 112 0С, τ = 30 хв, Р = 0,05 МПа, КУО <1 рН = 6,2 Для розчину мінеральних  солей: T = 131 0С, Р = 0,15 МПа, τ = 60 хв, КУО < 1. рН перед стерилізацією  = 4. Після стерилізації доводять до 6,2 Режим стерилізації соєвої олії: T = 131 0С, Р = 0,15 МПа, τ = 60 хв, КУО < 1.
К3.5 приготування та стерилізація піногасника	Тиск, час, температура, мікробіологічна  чистота	Термометр, годинник, манометр.	Температура, час та тиск контролюють під час стерилізації, мікробіологічний контроль проводять  після стерилізації	T = 131 0С, Р = 0,15 МПа, τ = 60 хв, КУО < 1.
К4.1Технологічний та мікробіологічний контроль вирощування культури в колбах К4.1.1Контроль вирощування (-)штаму К4.1.2  контроль вирощування (+) штаму	Час, температура, частота обертання  ротаційного шейкера, концентрація сторонньої мікрофлори, концентрація біомаси	Годинник, термометр, мікроскоп.	Безпосередньо під час  процесу. Мікробіологічний контроль  через кожні 8 годин під час вирощування шляхом прямого мікроскопіювання	τ= 48 год, t = 25-27 0С, η = 250 об/хв.,-наявність сторонньої мікрофлори не допускається Х = 21г/л
К4.2Технологічний та мікробіологічний контроль вирощування посівного матеріалу І генерації К4.2.1Контроль вирощування (-)штаму К4.2.2  контроль вирощування (+) штаму	Час, температура, частота обертання  ротаційного шейкера, концентрація сторонньої мікрофлори	Годинник, термометр, мікроскоп	Безпосередньо під час  процесу. Мікробіологічний контроль  через кожні 8 годин під час вирощування шляхом прямого мікроскопіювання	τ= 48 год, t = 27 0С, η = 250 об/хв.,- наявність сторонньої мікрофлори не допускається Х = 21 г/л
К4.2Технологічний та мікробіологічний контроль вирощування посівного матеріалу ІІ генерації К4.2.1Контроль вирощування (-)штаму К4.2.2  контроль вирощування (+) штаму	Час, температура, частота обертання  ротаційного шейкера, концентрація сторонньої мікрофлори	Годинник, термометр, мікроскоп, фізичні методи встановлення кількості обертів мішалки	Безпосередньо під час  процесу. Мікробіологічний контроль  через кожні 8 годин під час вирощування шляхом прямого мікроскопіювання	τ= 48 год, t = 27 0С, η = 250 об/хв.,- наявність сторонньої мікрофлори не допускається Х = 21 г/л
К5.1 Хімічно-технологічний та мікробіологічний контроль процесу виробничого культивування	Температура,час, кількість  обертів мішалки,об’єм повітря, концентрація культури. Наявність сторонньої мікрофлори	Термометр, годинник, фізичні  методи встановлення кількості обертів, ваги технічні, мікроскоп	Під час процесу. Мікробіологічний контроль – кожні 8 годин впродовж культивування.	V пов = 6 л/хв..; η = 250 об/хв; τ = 120 год.; t1 = 320С ; t2 = 22 0С наявність сторонньої мікрофлори не допускається Х = 42 г/л  Р= 1,6 г/л

 

           

 

 6.4 Методика визначення основних параметрів біосинтезу

6.4.1Визначення  кількості лікопіну

0,5 мл культуральної рідини розводили 1 мл води та центрифугували. Осад після центрифугування знову суспендували в 1 мл 96% етанолу та центрифугували. Осад збирали та гомогенізували хлороформом у пробірці Поттера.  Хлороформ збирали, та продовжували процес свіжими порціями. Вказану процедуру повторювали доти. Поки фракція хлороформу не переставала поглинати забарвлення. Зібрані фракції хлороформу  об’єднували та доводили загальний об’єм до 10 мл. Рівень лікопіну визначали за допомогою високоефективної рідинної хроматографії.Зразки для аналізу отримували шляхом розведення 0,5 мл екстракту хлороформу 95 мл ацетону [2].

Колонку заповнюють адсорбентом, який суспендований у розчиннику. Суспензію вносять в адсорбційну трубку поверх шару вати, накритого клаптиком фільтрувального паперу. У міру протікання розчинника частинки адсорбента осідають. Для прискороення фільтрації розчинника під час заповнення колонки можна застосувати вакуум. Колонка весь час повинна бути покрита розчинником. За постійного вакууму екстракт пігментів у петролейному ефірі наливають  у колонку і промивають кількістю петролейного ефіру. При цьому каротин швидко проходить через колонку в елюат, а супутні йому пігменти повністю адсорбуються на оксиді алюмінію. Останні краплини розчинника, що витікає, повинні бути безбарвні. Зазначають об’єм елюату в циліндрі, вимірюють оптичну щільність розчину каротину при синьому світлофільтрі та довжині хвилі 440 нм. За стандартною кривою визначають концентрацію каротину в 1 мл [37] .

6.4.2 Метод визначення азоту в середовищі

Основним методом визначення азоту в органічних з’єднаннях є  метод К’єльдаля. В основі методу лежить здатність амінокислот утворювати розчинні з’єднання з міддю, кількість якої визначають йодометричним титруванням. Суть методу полягає в тому, що до слабо лужного розчину амінокислот додають надлишок суспензії ортофосфату міді Cu3(PO4)2 у боратному буферному розчині. При цьому утворюються розчинні мідні з’єднання. Для їхнього відділення від нерозчинного ортофосфату міді суміш фільтрують. Потім до фільтрату прибавляють оцтову кислоту, яка відщеплює мідь від комплексного з’єднання і перетворюється в ацетат міді.

Для визначення кількості  міді, яка брала участь в реакції, до розчину добавляють йодид калію:

2Cu(CH3COO)2 + 4KJ = J2 + 2CuJ + 4CH3COOK (7.2)

В результаті реакції виділяється йод в кількості, еквівалентній кількості міді, а відповідно, і азоту амінокислот, який відтитровують розчином тіосульфату натрію:

J2 + 2Na2S2O3=2NaJ + Na2S4O6 (7.3)

1 мл 0,01 н розчину тіосульфату натрію відповідає 0,28 мг амінного азоту.

           Йодометричний метод визначення сумарної кількості амінокислот відрізняється продуктивністю і простотою і може бути рекомендований для

оперативного контролю технологічних  процесів бродильних [38]

6.4.3Метод визначення цукрів у середовищі

Хімічні методи основані на окисленні вільної альдегідної  або кетонної

групи цукрів оксидами важких металів. Оксиди металів, окислюючи  цукор,

самі при цьому відновлюються. Цукри, що здатні відновлювати окислювачі, називають редукуючими. До редукуючих вуглеводів, зокрема, відносяться всі моносахариди, інвертний цукор, мальтоза, мальтотріоза та деякі інші продукти гідролізу крохмалю.

Суть методу Бертрана полягає в тому, що на аналіз беруть однакові об’єми (по 20 см3) розчинів Фелінга І, Фелінга ІІ і цукру. Загальний об’єм суміші повинен бути завжди рівний 60 мл. Суміш кип’ятять точно 3 хв. Утворений червоний осад оксиду міді (І) відфільтровують, промивають і розчиняють сульфатом заліза (ІІІ) (замість сульфату заліза часто використовують сульфат амонію–заліза (ІІІ) (галун) в присутності сірчаної кислоти. При цьому оксид міді (І) кількісно окислюється тривалентним залізом,відновлюючи його в двохвалентене за рівнянням:

Си₂О + Fe₂(SO4)3 + H2SO4 = 2CuSO₄ + 2FeSO₄ + H₂O

Кількість сульфату заліза (ІІ), яке еквівалентне кількості  оксиду міді (І), визначають титруванням перманганатом калію, який окислює його в сульфат

заліза (ІІІ). Про закінчення реакції свідчить поява рожевого забарвлення розчину. Реакції протікають за рівнянням:

2KMnO₄ + 10FeSO₄ + 8H₂SO₄ = 5Fe₂(SO₄)₃ + K₂SO₄ + 2MnSO₄ + 8H₂O

В дослідній пробі повинно  бути не менше 10 і не більше 100 мг цукру [38].

6.4.4Метод визначення концентрації біомаси

Біомасу відділяють від культуральної  рідини шляхом фільтрації. Концентрацію визначають ваговим методом шляхом висушування до постійної маси.

6.4.5 Мікробіологічний контроль

Першим етапом є перевірка чистоти культуральної рідини: проводиться з використанням методу мікроскопіювання, результати методу вважаються позитивними, якщо виявлено лише клітини культури-продуцента. Для визначення вмісту бактерій, грибів та дріжджів здійснюють розсів до ізольованих колоній на МПА (для бактерій) та агарСабуро (для грибів і дріжджів).

Посіви на МПА інкубують  при 35 ⁰С (результати посівів слід враховувати через 48 та72 години), а на агар Сабуро – 24 ⁰С напротязі від 3 – 5 діб.

 

 

 

ВИСНОВКИ

1. Біотехнологічний шлях отримання лікопіну має такі переваги: він є відносно дешевим; лікопін отриманий таким способом легко засвоюється організмом людини.
2. Здатність до синтезу лікопіну виявлена у бактерій, грибів, актиноміцетів. Найактивнішим продуцентом сполуки вважають гетероталічний мукоровий гриб Blakeslea trispora.
3. Перевагою використання мукорового гриба є отримання хімічно чистого лікопіну. Він росте на простому та доступному поживному середовищі. Досягти надсинтезу можна шляхом зміни умов культивування та шляхом використання мутантних штамів.
4. Для вирощування посівного матеріалу використовують середовище, яке забезпечує максимальний рівень росту культури, при цьому цільовий продукт практично не утворюється.
5. Кількісний склад експериментального поживного середовища відрізняється від складу теоретично можливого. Це пов’язано з особливостями посівного матеріалу, а також з умовами культивування.
6. Процес ферментації проводять глибинним способом за періодичного культивування.
7. Субстратом для утворення каротиноїдів є ацетил-КоА – попередник мевалонової кислоти.
8. Лікопін – це тетратерпен, що складається з восьми ізопреноїдних залишків, які  мають  11 сполучених та 2 некон’югованих подвійних  зв’язків. Він сприяє підвищенню антиоксидантного потенціалу організму шляхом збільшення активності ферментів. У вигляді різних лікарських форм його застосовують для комплексної профілактики ряду онкозахворювань, також при лікуванні катаракти, атеросклерозу, ішемічної хвороби серця.

 

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Pat. 7.883.731 USA, C12C 5/04 . Natural coloring products / Hartal; D. Raveh; Y. Wolf . – Publ. 8.02.2011
2. Пат. 2270868 МПК 4 C12P23/00 Способ получения ликопина, фосфолипидов, жирных кислот и эргостерина путем совместного культивирования (+) и (-)штаммов гриба Blakeslea trispora / П.Б. Авчиева,  И.А. Буторова, С.В. Деев, Л.В. Зорина. – Опубл. 27.02.2006.
3. Захаренко М.О., Шевченко Л.В., Кучер В.А., Тристан Ю.В. Вплив лікопіну гриба Вlakeslea trispora на вміст вітаміну А та каротиноїдів в жовтках яєць перепелів // Журн. Годівля. – 2011. –Т.106, №9. – С. 6–9.
4. A. M. Helmenstine Biochemistry of Lycopene. How does it protect against cancer?  – 2011.  chemistry.about.com.
5. Авчиев М.И. Разработка технологии получения ликопина на основе пары штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+): Автореф. дис ВАК 05.18.10 канд. техн. наук. – Москва,2003. – 152с.
6. Меморская А.С., Феофилова Е.П., Терешина В.М.. Миликопин – новое лекарственное средство с иммуномодулирующей и антиоксидантной активностями для лечения рака простаты // Иммунопатология, аллергология, инфектология . – 2006. – Вип. № 1. – С. 9-13.
7. Кунщикова Е.А. Промышленные способы производства ликопинсодержащей биомассы гриба Blakeslea trispora - натурального сырья для получения ликопина, дефицитного пищевого красителя, обладающего ценной биологической активностью // Біотехнологія. Наука. Освіта. Практика: тези доповідей IV Міжнародної науково-практичної конференції. – Дніпропетровськ: 2008. – С. 36-38.
8. Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования: дис. 03.00.23 докт. биологии. – Кишенев, 2005. – 129с.
9. Mantzouridou F., Tsimidou M.Z. Lycopene formation in Blakeslea trispora. Chemical aspects of a bioprocess  // Trends in Food Science&Technology. – 2008. – V. 19, N.7. – P.363-371.
10. Feofilova E.P., Tereshina V.M., Memorskaya A.S., et al. Fungal Lycopene: the Biotechnology of Its Production and Prospects for Its Application in Medicine // Appl.  Mikrobiol. – 2006. – V. 75, N.6. – Р. 725-730
11. Пат. 007616 RU, МКИ 4 C12N 1/14 .Штамм Blakeslea trispora и способ его применения / С.Алберт, Е.А.Вавилова, Я.В. Фляг, Е.С.Морозова и др. – Опубл. 29.12.2006, Бюл. №6.
12. Голембіовська С.Л. Характеристика і біотехнологічний потенціал CRT ⁺ - Streptomyces globisporus 1912: Дис. ВАК 03.00.07 канд.біол.наук.- Київ, 2011. – 139 с.
13. Анацький А. С., Кунщикова Є. О. Вплив ступеня аерації культуральної рідини на біосинтетичну активність грибної культури  Blakeslea trispora // Вісник Дніпропетровського університету. Біол. Екол. – 2009. – Вип. 17, т. 2. – С. 15–19.
14. Бабич Я., Ляпустіна О.В., Зубарева І.М. Хімія та сучасні технології. Тези доповідей V міжнародної науково-технічної конференції студентів, аспірантів та молодих вчених. – Дніпропетровськ. 2011. –С. 459.
15. Бондарь И.В. Производство ликопина. Отчет ООО НПП «Витан» . – 2011 г. www. bio-x.ru.
16. Соловьев В. С. Фармако-токсикологическое обоснование применения препаратов ликопина в животноводстве и ветеринарии: Автореф.  дис. 06.02.03 канд. вет. наук. – Краснодар,2010. – 197 с.
17. Goñi I, Serrano J, Saura-Calixto F. J Bioaccessibility of beta-carotene, lutein, and lycopene from fruits and vegetables // Agric Food Chem.  – 2006. – 54, №15. – Р.205-226.
18. Пирог Т.П., Ігнатова О.А. Загальна біотехнологія: Підручник. – К.: НУХТ, 2009. – 336 с.
19. Lopez-Nieto M. J., Costa J., Piero E. et al. Biotechnological lycopene production by mated fermentation of Blakeslea trispora // Appl.Microbiol.Biotechnol. – 2004. – V.66, N.2 – P.153-159.
20. Гесслер Н.Н., Соколов А.В., Быховский В.Я., Белозерская Т.А. Активность супероксиддисмутазы и каталазы у каротинсинтезирующих грибов Blakeslea trispora и Neurospora crassa в условиях окислительного стресса // Прикладная биохимия и микробиология. – 2002. - Т. 38. - С. 237-242.]
21. Пат. 2406757 C12N 1/16, C12P 23/00. Штамм дрожжей Rhodosporidium diobovatum – продуцент каротиноидов / Вустин М.М., Великая М.А., Синеокий С.П. – Опубл. 10.07.2009.
22. Голембіовська С.Л., Тимошенко С.Г., М</s