Біосинтез лікопіну

 Приготування миючих  та дезинфікуючих засобів. Для  підготовки приміщень використовують  універсальний миючий розчин  та розчин хлораміну. Використовують саме хлорамін, а не хлорне вапно, тому що він стійкіший до дії факторів зовнішнього середовища та не втрачає свою активність при тривалому зберіганні. Для миття обладнання та комунікацій застосовують каустичну соду, оскільки вона добре розчинна у воді та добре видаляє жири.

          Підготовка стерильного технологічного повітря.

Атмосферне повітря разом  із супутніми газами містить також  часточки пилу та бруду, саме тому воно потребує попередньої очистки. Повітря  забирають на висоті 30 метрів, де стабільно  низька концентрація мікроорганізмів. Найпростішим методом очищення повітря  є пропускання його через фільтри  різного типу. Для очистки від  пилу та механічних часток використовують фільтри грубого очищення. Прикладом  такого фільтру може бути ФяР – фільтр ячейковий повітряний, який призначений для очищення повітря від пилу в системах припливної вентиляції, а також в різних технологічних агрегатах і системах. Ефективність очищення повітряними фільтрами до 80%. Далі проводять очищення повітря на головному фільтрі. Ступінь чистоти отриманого повітря становить 90%. Остання операція даної стадії – стерилізація повітря в індивідуальному фільтрі, Е = 99,99% [16]

Приготування  поживного середовища. Ця стадія складається із низки операцій. Це пов’язано з тим, що поживне середовище для культивування в качалочних колбах та на наступних етапах відрізняється. Крім того дозування компонентів також різне. Компоненти поживного середовища готуються максимально разом. Це зумовлює зменшення стадій технологічного процесу, а отже він стає економічно-вигідним. Цукровмісні компоненти стерилізують окремо за температури 112 ⁰С та тиску 0,05 МПа. Тривалість стерилізації – 30 хвилин. Солі також стерилізуються окремо, але параметри стерилізації у них відрізняються. Процес відбувається протягом 60 хвилин за температури 131 ⁰С та тиску 0,2 МПа. Різниця режимів зумовлена тим, що цукровмісні компоненти не витримують високих температур та тиску, вони карамелізуються.

         Підготовка інокуляту та посівного матеріалу. Для засіву виробничого середовища за глибинного способу культивування посівний матеріал готують також глибинним способом. Посівний матеріал отримуєть в декілька етапів: вирощування культури на рідкому середовищі в колбах на качалці; культивування продуцента в інокуляторі та в посівному апараті.

Колби із поживним середовищем  засівають музейними культурами, які змивають із скошеного агаризованого  середовища. Особливістю технологічного процесу є те, що культура гетероталічна, і на стадії підготовки посівного  матеріалу (+) та (-) штами вирощують  окремо. Колби встановлюють на ротаційний шейкер, який обертається з частотою 250 об/хв.  Культуру  з колб переносять у інокулятори.  Через індивідуальні фільтри подають стерильне повітря та вирощують 48 годин дотримуючись певних температури та тиску. Частота обертів мішалки інокулятора становить 250 об/хв. Після завершення процесу посівний матеріал перекачують у посівний апарат також подають стерильне повітря та вирощують 48 годин дотримуючись встановленого режиму. Після завершення процесу посівний матеріал перекачують у виробничий ферментер.

Виробниче культивування. Посівний матеріал із посівних апаратів перекачують до промислового ферментера. Тут штам (-) та (+) культивують разом. У ферментері вже є стерильне поживне середовище. Також подають стерильне повітря, адже гетероталічний мукоровий гриб Blakeslea trispora є аеробом.

Ферментер на 60% заповнюють інокульованим середовищем та посівним матеріалом. Решта 40% відводиться на повітря. Внаслідок аерації утоворюється піна, яка погіршує якість ферментації. Для її знешкодження використовують піногасники.

Ферментація проводиться  періодичним способом із додаванням підживлюваного розчину. Тривалість культивування - 120 годин.

 В процесі виробничого  біосинтезу вимірюються необхідні  для Blakeslea trispora параметри культивування (рН 6,2-6,8; концентрація розчиненого кисню). Під час ферментації кожні 4-8 год. відбирають проби культуральної рідини та здійснюють мікробіологічний та хіміко-технологічний контроль.

Технологічний контроль –  дотримання всіх параметрів (тиск, температура, тощо).

Хімічний – контроль складу середовища та культуральної рідини, концентрації біомаси, вмісту барвника.

Мікробіологічний – контроль за ростом і розвитком продуценту, а також визначення сторонньої мікрофлори на всіх стадіях від поживного  середовища до закінчення ферментації .

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РОЗДІЛ 5. Характеристика біологічного агенту

5.1.Морфолого-культуральні ознаки

 Мікроскопічний мукоровий  гриб Blakeslea trispora (Рис 5.1.) використовується в промисловості в якості продуцента каротиноїдів, та лікопіну зокрема.  Він має добре розвинений повітряний міцелій від сірувато-жовтого до жовтого забарвлення у (+) форми, та жовтого у (-) форми. Субстратний міцелій щільний. Гриб здатен до інтенсивної споруляції [28] .

Рис.5.1. Гриб Blakeslea trispora

Однак, залежно від штаму  та середовища на якому він культивується  колонії можуть мати різний колір. Так, на сусло-агарі ріст колоній обмежений; повітряний міцелій переплетений та має світло-малинове забарвлення, не пухкий; спороутворення не дуже інтенсивне.

На агаризованому середовищі СМ 17-1 ріст колоній обмежений. Колонії  плоскі; повітряний міцелій щільний, рожевий, трішки припіднятий в центрі колонії.

На середовищі GAT для Blakeslea trispora з глюкозою, аспарагіном та тіаміном ріст уповільнений та слабкий. Повітряний міцелій білий, трішки припіднятий. Субстратний міцелій розвинений нерівномірно, має помаранчеве забарвлення. Спророутворення слабке [29] .

 Спори безстатевого споронасіння (Рис 5.2) отримали назву поперечносмугасті.

Рис 5.2. Спорангієносець зі спорангієм гетероталічного мукорового гриба Blakeslea trispora

Для Blakeslea trispora характерні продовгувато овальні спори, що розташовані на довгих гіфах повітряного міцелію. Спорангії із спорангіоспорами розвиваються на субстратному міцелії, мають висоту 1-4 мм , 13-20 мкм шириною, безбарвні, з гладенькими стінками. Молоді спори мають біле забарвлення, яке з віком змінюється до темно –коричневого. 

Зигоспори зазвичай мають  діаметр 40-80 мкм, кулясті та злегка сплюснуті  В умовах постійного оновлення компонентів  поживного середовища та неперервного виведення метаболітів гіфи гриба  здатні до необмеженого росту. Гіфи мають  апекси та пухирці [30] .

Оптимальне агаризоване  середовище – сусло-агар. При спільному  культивуванні (+) та (-) штамів на агарі  утворюється широка  контактна  зона (3-3,5 см) інтенсивного помаранчевого  чи помаранчево-малинового кольору .[28]

5.2 Фізіолого-біохімічні ознаки

Ефективність ростових і  біосинтетичних процесів культури Blakeslea trispora як аеробного мікроорганізму визначається режимом аерації ферментаційного середовища. Залежно від ступеня насиченості киснем культуральної рідини, змінюються такі параметри росту культури, як загальний рівень біомаси, абсолютна та питома швидкість росту, інтенсивність споживання субстратів і накопичення цільових продуктів. Надлишок кисню може бути токсичним для даного гриба-продуцента, оскільки він не володіє розвиненими ферментними системами руйнування перекисних сполук (зокрема, пероксиду водню). Для захисту клітин він продукує більше β-каротину – одного з найпотужніших природних антиоксидантів [11] .

Гриб є мезофільним  мікроорганізмом [31], найінтенсивніший ріст його спостерігається в температурних межах від 20⁰ С до 34⁰С [10] .Оптимальне значення рН близьке до нейтрального (рН 6,2 – 8,4). Значення рН для Blakeslea trispora не є критичним параметром, однак він повинен бути в межах від 6,2 до 8,4 [10] .

В якості джерела вуглецю  використовують легкозасвоювані цукри. Ці сполуки являють собою суміші моно та дисахаридів. Прикладом може бути декстроза, глюкоза, фруктоза чи мальтозні сиропи [10] .Джерелами азоту для даного гриба є неорганічні та органічні речовини. До органічних відносять соєве борошно, кукурудзяний екстракт, джріжджовий екстракт, кукурудзяне борошно. Також мікроорганізм потребує додаткових факторів росту, зокрема вітамінів.

Гриб є ауксотрофом  за тіаміном, тому останній є обов’язковим компонентом поживного середовища. Середовище також повинно містити рослинні олії, що стимулюють утворення каротиноїдів [10] .

Встановлено, що біомаса  гриба Blakeslea trispora характеризується високим вмістом сухої речовини (90,9 – 91,23 %) та низькою вологістю, яка не перевищує 10%.

Вміст сирого жиру в біомасі  коливався в межах 56,34 – 67,63%, а  рівень сирої клітковини 3,59 – 5,92% ( табл. 5.1).

Рівень сирого протеїну в  лікопіновій біомасі складав 17,88 – 18,79% .

 

Таблиця 5.1

Хімічний склад лікопінової біомаси гриба Blakeslea trispora   

Хімічний склад	Середнє значення	Межі коливань
Суха речовина	91,07±0,10	90,90-91,23
Вологість	8,93±0,10	8,77-9,10
Сирий жир	61,15±3,36	56,34-67,63
Сира клітковина	4,82±0,68	3,59-5,92
Сирий протеїн	18,20±0,30	17,88-18,79
Сира зола	6,35±0,45	5,67-7,20

Особливістю амінокислотного  складу лікопінової біомаси є  високий вміст у ній глутамінової кислоти (19-20%), лейцину (8-9%), аспарагінової  кислоти(7-8%), та аланіну (7%) відносно загального вмісту амінокислот (таблиця 5.2)                                                                                 

   Таблиця 5.2

Загальний вміст амінокислот  лікопінової біомаси Blakeslea trispora

Амінокислота	Середнє значення	Межі коливань
Аспарагінова кислота	0,78±0,01	0,77-0,81
Треонін	0,52±0,01	0,51-0,52
Серин	0,39±0,01	0,38-0,39
Глутамінова кислота	2,02±0,01	1,99-2,05
Пролін	0,61±0,01	0,60-0,62
Гліцин	0,59±0,01	0,57-0,61
Аланін	0,75±0,01	0,74-0,76
Цистин	0,25±0,01	0,25
Валін	0,63±0,01	0,63
Метионін	0,26±0,01	0,25-0,26
Ізолейцин	0,57±0,01	0,56-0,60
Лейцин	0,90±0,01	0,89-0,92
Тирозин	0,31±0,01	0,31
Фенілаланін	0,45±0,01	0,45-0,46
Гістидин	0,56±0,01	0,55-0,57
Лізин	0,42±0,01	0,41-0,44
Аргінін	0,34±0,01	0,34

 

Таким чином показано, що лікопінова біомаса гриба Blakeslea trispora є джерелом повноцінних білків, жирів, незамінних амінокислот, а також ряду інших біологічно активних сполук. Серед них мінеральні речовини – фосфор і кальцій (таблиця 5.3) [32] .

Таблиця 5.3

Вміст  лікопіну,вітамінів, мікро- та мікроелементів у біомасі

Blakeslea trispora

Біологічно активні  речовини	Середнє значення	Межі коливань
Фосфор, г/кг	13,40±1,31	11.52-15.93
Кальцій, г/кг	1,28±0,03	1.24-1.33
Цинк, мг/кг	140,72±1,38	138.85-143.40
Марганець, мг/кг	33,33±0,73	31.95-34.45
Залізо, мг/кг	113,97±0,79	113.10-115.55
Мідь, мг/кг	11,15±0,13	10.95-11.40
Кобальт, мг/кг	<0.1	<0.1
Токоферол, мг/кг	3400,83±125,40	3251.50-3650.00
Рибофлавін, мг/кг	29,28±0,41	28.75-30.10
Лікопін, %	4,77±1,04	2.7-6.0

 

Гетероталічний гриб Blakeslea trispora є хемоорганогетеротрофом. В якості джерела енергії він використовує хімічні речовини; в якості донора електронів – органічні речовини; в якості джерела вуглецю використовує органічні сполуки.

Безстатеве розмноження  здійснюється за допомогою спорангіоспор. Вони утворюються лише на септованому  міцелії. Для зрілих форм характерним  є підвищений вміст ліпідів. Зовнішній  шар клітинної стінки у них тонкий, внутрішній – товстий [33] .

5.3.Таксономічний статус біологічного агента.

Згідно із систематикою 70-80-х  років Blakeslea trispora належить до відділу Eumucota, класу Zygomycetes, родини Choanephoraceae, роду Blakeslea.

У 1998р. була опублікована систематика  грибів Кавалір-Сміта, згідно з якою гриб Blakeslea trispora належить до царства Fungi , підцарства Eomucota, відділу Archemycota, класу Zygomycetes, родини Choanephoraceae, роду Blakeslea.

Згідно із сучасною філогенетичною класифікацією, опублікованою в 2007 році, гриб Blakeslea trispora належить до: царства Fungi, відділу Zygomycota, порядку Mucorales , родини Choanephoraceae, роду Blakeslea, виду Blakeslea trispora Thaxt. 1914 [34]