Водорастворимые полисахариды из лекарственных и пищевых растений

Степень полимеризации инулина равна, примерно, 35 моносахаридным  
остаткам.

Фруктаны типа флеана, найденные в злаковых растениях, также содержат D-фруктозу в фуранозной форме, но со связями–(2→6). Они поддаются очистке с большим трудом, чем инулин, и детали их строения полностью не выяснены.

 

Исследования некоторых растений

 

 

Клевер луговой

 

Клевер луговой (Trifolium pratense L.) относится к семейству бобовых (Fabaceae). Это многолетнее травянистое растение высотой 15–50 см, произрастает во всех степных, лесостепных и лесных районах, а также в полярно-арктической области, на суходольных и пойменных лугах, лесных вырубках и полянах, в разреженных березовых лесах и сосновых борах, по лесным опушкам, иногда около жилья, по окраинам полей, вдоль полевых и лесных дорог.

Данное растение широко используется в народной медицине как отхаркивающее, мочегонное, мягчительное, болеутоляющее, как средство, повышающее аппетит, и антисептическое средство, при туберкулезе,  упадке  сил,  похудании,  при  злокачественных  опухолях,  бронхиальной  астме,  как  противокашлевое при коклюше, при малярии, мигрени, маточных кровотечениях, болезненных менструациях.

В  проведенных    ранее  исследованиях  было  установлено,  что  водорастворимые  полисахариды из травы клевера лугового проявляют выраженные иммунотропные свойства и перспективны для терапии IgE-зависимых заболеваний (атопического дерматита, бронхиальной астмы, атопического ринита, крапивницы, пищевых аллергий и др.). 

Цель  данного  исследования  –  изучение  химического  состава  водорастворимых  полисахаридов  из травы клевера лугового.

Общие аналитические методы. Содержание уроновых кислот (УК) в водорастворимых полисахаридах и во фракциях определяли карбазольным методом (модификация c добавлением сульфаминовой кислоты)  с применением градуировочного графика, построенного для галактуроновой кислоты; белка – по методу Брэдфорда  с использованием градуировочного графика для бычьего сывороточного альбумина, 

нуклеиновых кислот – по методу Спирина.

Выделение водорастворимых полисахаридов (ВРПС). ВРПС выделяли из травы клевера лугового по следующей методике: 20,0 г травы клевера экстрагировали раствором 400 мл очищенной воды и 2 мл концентрированной HCl (pH=4,0) при соотношении сырье: экстрагент – 1:20, при нагревании на кипящей одяной  бане  и  периодическом  перемешивании  в  течение  3–4  ч.  После  отделения  частиц  сырья  путем фильтрования  через  многослойный  тканевый  фильтр  фильтрат  упаривали  на  роторном  испарителе  при температуре не более 50 °С до 1/5 от исходного объема. К полученному раствору добавляли троекратный объем 96%-ного этанола и отстаивали 24 ч при температуре 2–4 °С, затем осадок отфильтровывали через бумажный фильтр и растворяли в 100 мл очищенной воды при перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч при комнатной температуре. Нерастворившийся остаток, представляющий собой мельчайшие частицы сырья и денатурированный белок, отделяли центрифугированием (4000 об/мин, в течение 30 мин). Центрифугат диализировали через полупроницаемую мембрану с диаметром пор 15 кДа в течение 48 ч в 50-кратном объеме очищенной воды при комнатной температуре и перемешивании на магнитной мешалке, меняя воду через 24 ч. После диализа раствор замораживали и лиофильно высушивали.

Результаты. Выход ВРПС из травы клевера составил 1,5±0,1% в пересчете на абсолютно сухое сырье. Содержание УК в ВРПС – 74,64±0,23%; нуклеиновых кислот – 0,018±0,001%; общий белок – 0,56±0,01%. При разделении ВРПС на DEAE-целлюлозе получена 31 фракция, из которых отобрано 5 основных фракций, содержащихся в наибольшем количестве (PS62-1, PS62-2, PS62-3, PS62-4, PS62-5).

В полученных фракциях определено содержание белка и УК спектрофотометрическим методом. Результаты представлены в таблице 1.

Из  таблицы  1  видно,  что  PS62-1  и  PS62-2  содержат  минорное  количество  УК  (от  1,58  до  2,44%). Фракция PS62-5 не содержит УК и, таким образом, представляет собой нейтральный полисахарид. В состав фракций PS62-3 и PS62-4 входит большое количество УК (от 40,99 до 48,98%), что свидетельствует о кислой природе ПС. Кроме того, только одна фракция PS62-1 содержит небольшое количество белка (около 1%), который может находиться как в связанной с полисахаридными молекулами форме, так и в виде свободной примеси.

 

Таблица 1.  Содержание уроновых кислот и белка во фракциях водорастворимых полисахаридов из травы клевера лугового

 

Для исследования мономерного состава PS62-1 – PS62-5 они были подвергнуты кислотному гидролизу с последующей дереватизацией и анализу методом газожидкостной хроматографии. Установлено, что в гидролизате PS62-1 в наибольшем количестве присутствуют остатки D-глюкозы (75,68%)   и D-галактозы (20,08%) в соотношении примерно 3,7 : 1. Остатки D-арабинозы (1,84%), D-рамнозы (0,35%) и D-ксилозы (0,5%) обнаружены  в  минорных  количествах.  Основными  мономерными  единицами  PS62-2  являются  остатки  D-галактозы  (27,97%)  и  D-глюкозы  (72,04%)  в  соотношении  2,6 : 1.  Основные  мономерные  звенья PS62-3 – остатки галактуроновой кислоты (38,75%), галактозы (33,16%) и рамнозы (15,52%) в соотношении 2,5 : 2,1 : 1; содержание ксилозы – 4,95%, арабинозы – 3,47% и глюкозы – 4,14%. Основные мономерные звенья полисахарида PS62-4 – остатки галактозы (37,32%), рамнозы (37,1%) и галактуроновой кислоты (25,57%).  Основные  мономерные  единицы  PS62-5  –  остатки  галактозы  и  рамнозы  в  соотношении  2:1 (табл. 2).

Таким образом, PS62-1, PS62-2, PS62-5 – это нейтральные ПС, а PS62-3 и PS62-4 – кислые ПС, основная  цепь  которых  представлена  участками  полигалактуроновой  кислоты,  между  которыми  могут  располагаться  единичные  остатки  L-рамнозы.  От  основной  цепи  идут  ответвления,  состоящие  из  остатков арабинозы и галактозы.

 

Таблица 2.  Мономерный состав полисахаридных фракций из травы клевера лугового

 

Фиалка Патрэна

Фиалка  Патрэна  —  Viola  patrinii  Ging.,  семейства фиалковых (Violaceae) представляет собой многолетнее травянистое растение, достаточно широко распространенное  во  флоре  России  (Восточная  Сибирь,  Дальний Восток).   Данный   вид   издавна   применяется   в Китайской и Тибетской медицине в качестве лечебного средства.  Надземная  часть  используется  как  дезинтоксикационное средство при туберкулезе легких и лимфатических  узлов,  а  также  при  пиодермии,  фурункулезе, злокачественных  новообразованиях,  дизентерии  и  как мягчительное  при  лечении  нарывов  и  незаживающих ран. Цветки в Китае применяют в онкологии.

Выделение. Водорастворимые  полисахариды  (ВРПС)  извлекали из воздушно-сухого шрота, оставшегося после экстракции 70 %-ным спиртом этиловым, 1,5 л воды при нагревании на водяной бане в течение 1ч. Повторное извлечение ВРПС проводили дважды при соотношении сырье — экстрагент (1:10). Сырье отделяли центрифугированием. Полученные объединенные экстракты упаривали под вакуумом до 20 % от первоначального объема. Затем полисахариды осаждали трехкратным количеством 96 %-ного спирта  этилового,  выпавшие  осадки  отфильтровывали под  вакуумом  и  последовательно  промывали  96  %-ным спиртом этиловым, ацетоном и высушивали.

Количественную оценку полисахаридного комплекса,  выделенного  из  надземной  части  фиалки  Патрэна проводили гравиметрическим методом.

Идентификацию  моносахаридного  состава  полисахаридного комплекса после их предварительного гидролиза серной кислотой (1 моль/л) проводили с помощью бумажной  (БХ)  и  высокоэффективной  жидкостной  хроматографии (ВЭЖХ). Для детального исследования состава полисахаридного  комплекса  использован  метод  ВЭЖХ.

Результаты. Методом  последовательной  экстракции  и  осаждением  спиртом  этиловым  из  травянистой  части  фиалки Патрэна получена полисахаридная фракция: ВРПС. Количественное  содержание  ВРПС  определяли  после высушивания гравиметрическим методом, и составляло 11,9 %.

Выделенный   комплекс   ВРПС   представлял   собой аморфный порошок желтовато-серого цвета, растворимый в воде, в водных растворах кислот и щелочей, но не растворимый  в  органических  растворителях,  осаждается спиртом и ацетоном. После кислотного гидролиза данный комплекс дает положительную реакцию с реактивом Фелинга.

 

Таблица 3.  Углеводный состав надземной части фиалки Патрэна

Методом  ВЭЖХ  в  исследуемом  комплексе  ВРПС установлен  качественный  состав  моносахаридов.  По времени  удерживания  стандартных  растворов  в  комплексе ВРПС идентифицировано 7 монсахаридов: рамноза,  ксилоза,  сорбит,  глюкоза,  фруктоза,  галактоза,манноза. Методом внутренней нормализации установлено, что преобладающими в комплексе ВРПС являются манноза,  фруктоза,  рамноза.  Результаты исследований представлены в табл. 3.

 

Смолевка обыкновенная

 

Cмолевка     обыкновенная     (Silene     vulgaris (Moench) Garke; Oberna behen (L.) Ikonn) – широко  распространенное  в  европейской  части  России лекарственное растение, произрастающее на берегах  рек,  в  светлых  лесах,  среди  кустарников,  на лугах. Как сорняк смолевка встречается в посевах и на огородах. Известно, что отвар надземной части  растения  используется  как  диурическое  и  отхаркивающее  средство,  наружно  –  при  кожных заболеваниях и ревматизме.

Ранее    выявлена  иммуномодулирующая активность силенанов интактного растения и каллусной  культуры  в  отношении  усиления  фагоцитоза.

Общие  экспериментальные  условия.  Общеесодержание  углеводов  определяли  фенол-серным методом,  содержание  уроновых  кислот  –  по реакции   с   концентрированной   H 2 SO 4     и   2,3-диметилфенолом,  белка  –  по  методу  Лоури.

Кислотный  гидролиз.  Навеску  полисахаридной  фракции  (3–5  мг)  нагревали  в  запаянной  ам-пуле 8 ч. при 100°С с 1 мл 2 М трифторуксусной кислоты, содержащей мио-инозит (0.3 мг). Гидролизат  упаривали  досуха,  прибавляя  по  0.5  мл  метанола, и исследовали методами БХ и ГЖХ.

Выделение.   Воздушно-сухое    измельченное растительное сырье (110 г) последовательно экстрагировали в аппарате Сокслета метанолом и хлороформом.  Полученный  воздушно-сухой  остаток сырья  (100  г)  несколько  раз  экстрагировали  дистилированной  водой (по  1  л)  при  перемешиваниив  гомогенизаторе  (20°С)  до  отрицательной  реакции по фенол-серному методу. Остаток отделяли  центрифугированием.  Объединенный  супернатант,  содержащий  раствор  полисахарида,  очищали от несвязанного белка следующим методом: экстракт  концентрировали  до  половины  объема  и при    интенсивном    перемешивании    подкисляли разбавленной  уксусной  кислотой  до  рН  4.5–4.8. Смесь выдерживали в течение 0.5 ч. и, если рН не повышался,  оставляли  на  ночь  при  +5–10°С.  Бе лок,  выпавший  в  осадок,  удаляли  центрифугированием.  Супернатант  диализовали  2  сут.  Против дист. воды, концентрировали до 50–100 мл и осаждали 3-кратным объемом 96%-ного этанола. Выпавший   осадок  отделяли   центрифугированием, растворяли  в  воде  и  лиофилизовали,  получили силенан SV1.

Остаток  сырья  экстрагировали  дистилированной водой при 70°С (по 1 л) до отрицательной реакции по фенол-серному методу [11]. Объединенные  экстракты  обрабатывали,  как  описано  выше.Получили  силенан  SV2,  который  объединяли  с силенаном SV1.

К   остатку  сырья   добавляли   подкисленную дист. воду (рН 4; 1 л) и при постоянном рН смесь выдерживали в течение 3 ч (50°С) при перемешивании. Обработанный остаток отделяли центрифугированием  и  экстрагировали  0.7  %-ным  водным оксалатом  аммония (по  1  л,  68°С).  Экстракциюпроводили  до  отрицательной  реакции  по  фенол-серному методу [11]. Экстракты  центрифугировали, объединяли и концентрировали до 50–100 мл. Полисахарид  осаждали  из  раствора  3-х  кратным объемом 96-процентного этанола. Выпавший  осадок  отделяли  центрифугированием,  растворяли  в минимальном   количестве   воды.   Подкисленный раствор (рН 4) диализовали 2 сут против дистилированной воды и лиофилизовали. Получили фракцию SV3.

Полисахаридные фракции SVK1 и SVK2 выделяли из каллуса S. vulgaris аналогичным путем, но без очистки от несвязанного белка (рисунок 1).

Ферментативный  гидролиз.  Образцы  силенанов (50 мг) растворяли в воде (20 мл), добавляли водный раствор пектиназы (2 мг, Ferak, Berlin), смесь инкубировали при 37°С в течение 3 ч. Далее реакционную смесь нагревали в течение 5 мин на водяной  бане  при температуре  100°С.  Скоагулированный  белок  отделяли  центрифугированием. Полученный   супернатант   концентрировали   до 3 мл  и  добавляли  в  96%-ный  этанол  (4-кратный объем).   Осадок   отделяли   центрифугированием. Спиртовой супернатант концентрировали и анализировали методом БХ. Осадок растворяли в воде и повторно  проводили  ферментативный  гидролиз  в течение 2 ч, добавив 2 мг пектиназы. Полученную смесь  обрабатывали,  как  описано  выше.  Остаток лиофилизовали,  гидролизовали  и  анализировали методом БХ.

Результаты. Схема  выделения  силенанов  приведена  на  рисунке 1.   Водорастворимые   фракции   силенанов получены  последовательной  экстракцией  интактного  растения  водой  при  20°С  и  при  70°С.  Для удаления сопутствующего белка применяли осаждение  белка  подкислением  экстракта  до  рН  4.5 –4.8. В результате были получены две фракции силенанов  интактного  растения:  SV1  и  SV2.  В  таблице  4  приведен  выход  полученных  силенанов  иих  аналитические  данные.  Общее  содержание  углеводов и гликуроновых кислот в обеих фракциях оказалось близким (табл. 4). Незначительные различия  наблюдаются  в  качественном  и  количественном  составе  нейтральных  моносахаридов  водорастворимых полисахаридов смолевки (табл. 4).

На основании полученных данных можно предположить,   что   обе  фракции   представляют   собой один и тот же полисахарид SV1.

Для  того  чтобы  выделить  пектиновый  полисахарид  из  нерастворимого  протопектина,  остаток растительного  сырья  обрабатывали  подкисленной водой  (рН  4)  и  экстрагировали  0.7-процентным водным раствором оксалата аммония. В результате  была  получена  полисахаридная  фракция  SV3, выход  которой,  а  также  аналитические  данные приведены в таблице 4, из которой видно, что силенаны  SV1  и  SV3  близки  по  моносахаридному составу.  Присутствие  в  гидролизатах  глюкозы  и маннозы  (табл.  1),  скорее  всего,  указывает  на  наличие   в   полисахаридных   фракциях   резервного глюкана и/или глюкоманнана.

Аналогичным путем  из  каллусной  культуры смолевки получены две полисахаридных фракции: силенан   SVК1   (водная   экстракция)   и   силенан SVK2 (экстракция оксалатом аммония). Выходы и аналитические   данные   для  силенанов   SVK1   и SVK2  представлены  в  сравнении  с  силенанами интактного растения (табл. 4).