Правила работы в вирусологической лаборатории

2. Разрушение ингибиторов фильтратом холерного вибриона. К одному объему прогретой при 56 °С в течение 30 мин сыворотки добавляют четыре объема фильтрата холерного вибриона и смесь инкубируют в течение 18...20 ч при 37 °С. После этого сыворотку вновь прогревают 1 ч при 56 °С. Обработанная таким образом сыворотка считается разведенной 1:5.

3. Удаление ингибиторов каолином. К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 0,8 мл физиологического раствора, прогревают при 56 °С в течение 30 мин и добавляют 1 мл 25%-ной взвеси каолина на физиологическом растворе. Смесь встряхивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют 10-20 мин при 2000 об/мин. После обработки сыворотка разведена 1:10.

Удаление ингибиторов с помощью каолина можно изменить, обрабатывая сыворотку непосредственно в панелях для микротитрования. Для этого в 1-ый ряд лунок вносят предварительно прогретые исследуемые сыворотки в объеме 0,02 мл и добавляют к ним 0,18 мл 12,5%-ной суспензии каолина. После встряхивания и центрифугирования пластины на специальной центрифуге осуществляют двукратные разведения абсорбированной сыворотки путем переноса петлей из лунки в лунку.

4. Разрушение ингибиторов периодатом калия. Готовят 0,05 М раствор периодата калия на дистиллированной воде. Для этого 1,15 г периодата калия (KJ0₄) растворяют в 100 мл дистиллированной воды при подогревании в водяной бане (70...80 °С) в течение 2...5 мин до получения прозрачного раствора. Для разрушения ингибиторов к одному объему неразведенной предварительно прогретой при 56 °С в течение 30 мин сыворотки крови добавляют один объем раствора периодата калия. Смесь оставляют при комнатной температуре на 2 ч, затем добавляют два объема 5%-ного раствора глюкозы для нейтрализации действия периодата калия (сыворотка разведена 1:4).

Компоненты РЗГА: 1-й вариант постановки — исследуемый вируссодержащий материал; диагностическая иммунная сыворотка; 1%-ная взвесь эритроцитов; 2-й вариант— исследуемая сыворотка крови; стандартный антиген (вирусный диагностикум); 1%-ная взвесь эритроцитов.

Постановка РЗГА включает следующие основные этапы: определение рабочей дозы вируса (1 ГАЕ), определение правильности выбора 4 ГАЕ и проведение основного опыта РЗГА.

Вначале в РГА определяют 1 ГАЕ, а для основного опыта используют от 2 до 8 ГАЕ, чаще всего 4 ГАЕ. Например, если 1 ГАЕ вируса соответствует разведению 1:160, то при подготовке рабочей дозы (4 ГАЕ) вирус разводят 1:40. Вирус в рабочем разведении готовят в объеме, необходимом для проведения основного опыта. Для приготовления рабочего разведения 1:40 берут 1 мл исходного вируса и 39 мл физиологического раствора. Правильность приготовления рабочей дозы (4 ГАЕ) определяют в дополнительном опыте. Для этого используют пластмассовую панель. В лунки панели, начиная со второй и включая шестую (контроль), вносят по 0,1 мл физраствора. Затем в первую лунку вносят 0,1 мл вируссодержащего материала (4 ГАЕ) и делают последовательные переносы. Из пятой лунки 0,1 мл выливают в дезраствор, в контрольную вирус не добавляют. Получают разведения вируссодержащего материала в 4 ГАЕ, 2 ГАЕ, 1 ГАЕ, 0,5 ГАЕ и 0,25 ГАЕ. Затем в каждую лунку, в том числе и контрольную,

тт Таблица 7

проверка правильности выбора 4 ГАЕ

Компоненты	Номера лунок
		1	2	3	4	5
Физраствор	-	0,1	0,1	од	од	j-VJri 1 LHJJJ i> 0 1
Вирус	0,1	г~ 0,1	г~*1— од	од	--   > - 0,1	в дезраствор
ГАЕ'	4	2	1	0,5	0,25
1 %-е эритроциты кур	0,1	0,1	0,1	од	ОД	од
-Экспозиция 4э...аи мин при комнатной темпрря™™.
учет результатов 1   +++   |  +++   |   ++    |     +-[-Е—"р-

Основной опыт РЗГА (для определения антител в исследуемой сыворотке). В лунки пластмассовой панели разливают по 0,1 мл физиологического раствора. Затем в первую лунку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и делают последовательные ее переносы. Из последней лунки 0,1 мл разведенной сыворотки выливают в дезраствор. Таким образом, получают разведения исследуемой сыворотки от 1:2 до 1:256. В каждую лунку вносят по 0,1 мл вируссодержащего материала в 4 ГАЕ и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. По истечении этого времени в каждую лунку добавляют по 0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур и снова оставляют при комнатной температуре. Одновременно ставят контроли:

а) контроль сыворотки (0,1 мл разведенной 1:10 сыворотки крови и 0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур);

б) контроль эритроцитов (0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур и 0,1 мл физраствора);

в) контроль вируса (0,1 мл антигена в 4 ГАЕ и 0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур).

Панели встряхивают и после 30...60 мин контакта учитывают реакцию (табл.8).

Учет результатов начинают с контролей. Они должны показать результат, отраженный в табл.8. При наличии соответствующих антител в исследуемых сыворотках происходит нейтрализация гемагглютинирующей активности вируса и задержка агглютинации эритроцитов. В первых лунках наблюдают положительную РЗГА: эритроциты оседают на дно лунки в виде компактной точки. В последующих лунках, где имеет место снижение титра антител, отмечают отрицательную РЗГА — агглютинация эритроцитов на 1,2 и 3 плюса. В 1-ом и 2-ом контролях агглютинация должна отсутствовать, а в 3-ем — агглютинация эритроцитов должна быть не менее, чем на 3 плюса.

РЗГА позволяет не только выявить специфические антитела, но и определить их титр. Титром антител в РЗГА называют наименьшее их количество, способное полностью задержать ге-магглютинацию. В нашем примере (табл.8) титр антител составляет 1:32.

Реакция задержки гемадсорбции (РЗГад). Ее применяют для обнаружения, идентификации и типизации вирусов в зараженной культуре клеток. Суть ее состоит в том, что антитела иммунной сыворотки, взаимодействуя с антигеном гемагглютини-рующих вирусов, размножающихся в культуре клеток, экранируют их, и в результате адсорбция эритроцитов на поверхности зараженных клеток не наблюдается.

Компоненты реакции:

1) инфицированная и неинфицированная гемагглютини-рующим вирусом культура клеток в пробирках;

2) Диагностическая противовирусная сыворотка;

3) 0,4%-ная взвесь эритроцитов кур.

Техника постановки. Из пробирок с культурой клеток сливают питательную среду, отмывают клетки от ее белковых компонентов, добавляя в пробирки 2-3 мл раствора Хенкса. После 1...2 мин экспозиции раствор Хенкса удаляют. Затем в каждую опытную и контрольную пробирки вносят по 0,2 мл диагностической сыворотки. Пробирки оставляют в наклонном положении, полосой вверх, и выдерживают при комнатной температуре 15...20 мин. Затем добавляют по 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов и снова оставляют на 3...5 мин в наклонном положении при комнатной температуре. В дальнейшем пробирки осторожно вращают 5-10 раз с целью ресуспендирования осевших, но не адсорбировавшихся эритроцитов.

Одновременно ставят следующие контроли:

1) контроль культуры клеток в норме (ростовую среду меняют на поддерживающую);

2) контроль диагностического (известного) вируса (клеточный монослой + вирус);

3) контроль нормальной сыворотки (клеточный монослой + нормальная сыворотка).

Учет РЗГад проводят под малым увеличением микроскопа. При положительной реакции эритроциты свободно плавают в поле зрения. Это обусловлено тем, что гемадсорбирующая способность вируса нейтрализована антителами специфической сыворотки. При отрицательной реакции происходит адсорбция эритроцитов на поверхности клеток.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Ознакомиться с компонентами РЗГА и реакции задержки гемадсорбции.

вносят по 0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур. Реакцию оставляют при комнатной температуре на 45...50 мин и проводят учет (табл.7). При правильном выборе 4 ГАЕ в первых двух лунках — агглютинация эритроцитов на 3+, в третьей (1 ГАЕ) — 2+, в контроле агглютинация отсутствует.

со

й

Я а

ей

и

вируса	с	Ч              гЧ э       о'	+ + +
Контроли эритроцитов ОД	а э а 1 3 3 1 3	гЧ о'	1
сыворотки 0 1		о" со а >■■	1 Щ а >> св
„ гН   _гН 00    - ^   ■ о р*о	(О Я  о	- н —- Й ft   -1 Я     о" а	ft- Я   + а  + g   +
.     1-Н 1_тН о р^о	СО СМ     тЧ ^   о гН	о    'I В     о Е-< Й	к- о И     г й    + я «а
,_  гЧ   _>Н о р*о	"* СО    "	« S 0        гН Я °" < п.	г; - Э « S     +
1 лунок 5 од	00    ^ <=	И                     Е К     .н      t 8     о     ' S           с ,-,          «	« 5   1 з 3
а £ °г°	<°     гЧ	и--- S   1   5 §■    о     с	J
„  "-I 1_гЧ СО    -  w   - о г^о	00     гЧ ■н   ©"	га - С 2               8 а     —1      с О           .        С и    о    с	--
„, гЧ __| СМ    -  |f  - о р*о	гЧ тН    о"	ГО 7—f о"
•н 1_|-Ч т-Ч О      О	<М     гЧ iH   о"	тЧ о"
Компоненты Физраствор Исследуемая сыворотка	s s5 d 0) ^* I-   «  о >> о>  >, ? § а	Л  И о р CD   Н « S П   д-« О к ft ^ s о. У- Си >> т-Ч   О   К	и о й н 2 &

101

2. Поставить и учесть результат РЗГА.

3. Просмотреть в микроскопе пробирки с положительным и отрицательным'результатами реакции задержки гемадсорбции.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация компонентов РЗГА и задержки гемадсорбции, техники постановки и учета результатов этих реакций.

4. Самостоятельная работа студентов: учет реакции по проверке правильности выбора 4ГАЕ; удаление ингибиторов из исследуемых сывороток с помощью С0₂; постановка РЗГА для обнаружения антител; постановка РЗГад; учет РЗГА и РЗГад.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Наиболее сложным и ответственным моментом является приготовление рабочей дозы вируса (4 ГАЕ) и подготовка сывороток крови. Очень важно, чтобы сыворотка надежно работала с вирусом. Самым доступным и полностью отвечающим назначению является вирус Ньюкаслской болезни (штамм Н) и специфическая сыворотка к нему (из диагностического набора). Специфическую сыворотку к вирусу Ньюкаслской болезни в большом количестве можно получить на кроликах путем их гипериммунизации.

Освобождение сывороток от ингибиторов имеет смысл провести демонстрационно для всей группы.

При выполнении данной работы группу делят на подгруппы в зависимости от наличия на кафедре материальных средств. Вопросы домашнего задания

1. Вирусы гриппа и парагриппа крупного рогатого скота.

2. В чем отличие непрямой гемагглютинации от прямой?

3. Принцип РИГА.

4. Постановка и учет РНГА.

ЗАНЯТИЕ 16. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

V Цель занятия: изучить компоненты, технику их подготовки, схему постановки и учета РНГА.

Оборудование и материалы: микротитратор системы Такачи или другой, растворитель для компонентов и постановки самой реакции, резиновая груша, эритроцитарный диагностикум, исследуемые и контрольные сыворотки, пипеточные дозаторы, пипетки на 1 мл, физиологический раствор, забуференный физраствор рН 7,2, эритроциты быка или барана, танин, акролеин или формальдегид, хлористый хром, останавливающий раствор; дистиллированная вода, таблицы по теме.

Краткие теоретические сведения

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) позволяет решить следующие диагностические задачи:

1) обнаружить антитела и определить их титр в исследуемых сыворотках крови;

2) обнаружить и идентифицировать неизвестный вирусный античен.

Сущность реакции состоит в том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, способны агглютинироваться в присутствии гомологичных антител или антигенов. Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген-антитело. Регистрируют данную реакцию по характеру образовавшегося осадка эритроцитов, т.о., она является сугубо специфической серологической.

Необходимо отметить, что РНГА отличается от РГА. В РГА эритроциты агглютинируются с рецепторами вирусов за счет своих комплементарных рецепторов. В РНГА агглютинация происходит за счет образования комплексов антиген + антителе (рис.55, 56). Если к поверхности эритроцитов присоединить антигены, получают антигенный эритроци-тарный диагности-кум, способный в исследуемой сыворотке определять антитела. И, наоборот, эритроциты, сенсибилизированные антителами, называют антительным эритроцитарным диагностикумом и применяют для быстрого обнаружения антигенов в различных субстратах.

Рис.55. Схема реакции гемагглютинации

Рис.56. Схема реакции непрямой гемагглютинации

Достоинства и недостатки РНГА. Эта реакция обладает высокой чувствительностью, превосходя РИД, РСК и приближаясь к иммуноферментному анализу, отличается простотой техники постановки и быстротой ответа (2...3 ч). Недостаток — определенные трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов.

Компоненты реакции. Для определения антител в исследуемых сыворотках необходимо иметь:

а) антигенный эритроцитарный диагностикум;

б) исследуемую сыворотку крови;

в) разбавитель (в нем ставится реакция).

Для определения антигенов в исследуемых биологических жидкостях необходимо иметь:

а) антительный эритроцитатный диагностикум;

б) исследуемый биологический субстрат;

в) разбавитель.

Постановка РНГА включает следующие основные этапы:

а) приготовление растворов и подготовка исследуемых жидкостей;

б) получение эритроцитарных диагностикумов; в) постановка главного опыта РНГА. Обычно в лабораториях ставят только главный опыт, а остальные процедуры проводят на предприятиях биологической промышленности.

Подготовка растворов и исследуемых жидкостей. Физиологический раствор, забуференный физраствор (рН 7,2), разбавитель готовят на дистиллированной воде. Физраствор готовят по общепринятой методике. Для приготовления забуференного физраствора с рН 7,2 к 1 л последнего добавляют 0,49 г КН₂Р0₄ и 1,62 г Na₂HP0₄, стерилизуют кипячением, охлаждают и используют в работе. Этот раствор применяют для отмывания эритроцитов, акролеинизации и танизации их.

Разбавитель готовят, добавляя к физраствору 0,3% фенола и 1% нормальной лошадиной сыворотки. Его используют для разведения исследуемых сывороток или других жидкостей, а также для хранения эритроцитарного диагностикума. Нормальную лошадиную сыворотку, исследуемые сыворотки и другие жидкости абсорбируют эритроцитами с целью освобождения от неспецифических гемагглютининов. С этой целью к одному объему проверяемой биологической жидкости прибавляют 0,1 объема осадка отмытых эритроцитов, пробирку со смесью встряхивают и выдерживают при 37 °С в течение 30 мин, затем центрифугируют, извлекают надосадочную жидкость и используют в работе.