Правила работы в вирусологической лаборатории

Возраст донора. Возраст донора, от которого получают эритроциты, в значительной степени влияет на их агглютинацию. Например, вирусы оспы значительно интенсивнее агглютинируют эритроциты взрослых кур, чем только что вылупившихся цыплят, а для многих арбовирусов и вирусов бешенства характерна обратная зависимость.

Индивидуальные особенности доноров. Известно, что один из факторов, определяющих пригодность эритроцитов животного данного вида для РГА — это индивидуальные различия в чувствительности эритроцитов к вирусу.

Среди других факторов, влияющих на способность эритроцитов агглютинироваться вирусами, можно отметить пол животного-донора.

Факторы окружающей среды, влияющие не РГА. Сильное влияние на агглютинацию эритроцитов вирусами оказывает температура. Одни вирусы агглютинируют эритроциты лучше всего или только при 4 °С, другие — при 37 °С, третьи — одинаково хорошо при любой температуре, хотя по соображениям удобства РГА обычно ставят при комнатной температуре (от 20 до 25 °С). Следует отметить, что пока еще не было обнаружено ни одного вируса, который агглютинировал бы эритроциты при этих температурах лучше, чем при 4 °С или при 37 °С.

Способность вируса агглютинировать эритроциты, в особенности в тех случаях, когда она слаба, как например, у арбовирусов, зависит также и от концентрации водородных ионов. Так, например, некоторые арбовирусы разрушаются при значениях рН, соответствующих оптимуму для вызываемой ими гемагглютинации. Вирус необходимо разбавлять раствором, рН которого отвечает условиям его стабильности, а затем доводить рН смеси до значения, оптимального для гемагглютинации, используя соответствующий разбавитель.

У некоторых вирусов способность агглютинировать эритроциты зависят от наличия или отсутствия в среде некоторых ионов, например, Са²⁺, Na⁺, Mg²⁺.

Иногда присутствие вирусных гемагглютининов маскируется наличием в системе ингибиторов сложного состава, поступающих из клеток, в которых размножался вирус. Перед постановкой РГА, эти ингибиторы удаляют путем прогревания, обработки ацетоном, эфиром, фторуглеродными соединениями, трипсином, ре-цепторразрушающим ферментом и высокоскоростным центрифугированием. Ингибиторы чаще встречаются в препаратах вирусов, полученных из тканей интактных животных, чем из культур клеток.

Компоненты реакции: исследуемый вируссодержащий материал (носоглоточные смывы, аллантоисная и амниотическая жидкости, содержимое кожных высыпаний и т.п.); 0,5% ...1%-ная взвесь эритроцитов; фосфатно-буферный (физиологический) раствор.

Схема постановки. РГА ставят в пластиковых панелях с равномерно округлым гладким дном. Вначале готовят 2-кратные последовательные разведения вируссодержащего материала (от 1:2 до 1:320 и выше). С этой целью в ряд лунок приливают 0,1 мл физраствора. Затем в 1-ю лунку добавляют 0,1 мл исследуемого вируссодержащего материала, перемешивают и 0,1 мл смеси переносят во 2-ую лунку и т.д. Из последней лунки 0,1 мл выливают в дезинфицирующий раствор. Во все лунки добавляют по 0,1 мл 0,5...1%-ной взвеси отмытых эритроцитов. Одновременно ставят

Таблица 6

Схема постановки реакции гемагглютинации (РГА)

Компоненты реакции	Номера лунок								Контроль
		1	2	3	4	5	6	7	8
Физиологический раствор	од	0,1	од	од	од	0,1	0,1	од	од
Вируссодержа щий материал	1 0,1	+1 од	од	ОД	il од	од	il од	+ | 0,1	+ в дезраствор
Получаемые разведения	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256
1 % -ная взвесь эритроцитов	0,1	од	од	од	од	од	од	од	од
Укспозиция при комнатной температуре 30...60 мин
Учет результатов	+++	+++	++	++	+	-	-	-	-

Титр вируса 1:16 (1 ГАЕ)

Учет и оценка результатов реакции. РГА учитывают визуально по форме образовавшегося осадка эритроцитов — гемагглю-тината (рис.53).

При резко положительной РГА ("+++") образуется рыхлый осадок (зонтик) на дне и стенках лунки; "++" — осадок только на дне лунки; "+" — наличие незначительной агглютинации эритроцитов на дне лунки; "-" — эритроциты оседают на дне лунки в виде точки с ровными краями (отрицательная).

Гемагглютинирущий титр вируса — это наибольшее разведение (наименьшее количество вируса), при котором наблюдается гемагглютинация не менее чем на "++". Это разведение соответствует одной гемагглютинирующей единице (1 ГАЕ, см. табл.6). В таком же объеме исследуемого (без разведения) материала таких единиц (доз) вируса будет больше во столько раз, во сколько раз пришлось развести материал, чтобы получить 1 ГАЕ. Так, если высшим разведением, еще дающим гемагглютинацию, оцениваемую на "++", будет 1:16 (табл.6), это значит, что в объеме титрования вируса, разведенного в 16 раз, содержится 1 ГАЕ, а в таком же объеме титруемого материала таких единиц будет 16, т.е. титр вируса Т в данном материале равен 16 ГАЕ.

Поскольку суспензию эритроцитов и вируссодержащий материал в разведениях берут в равных объемах, то безразлично, на какой объем будет приходиться 16 ГАЕ, ибо с возрастанием объема одного компонента во столько же раз увеличивается и объем другого. Поэтому соотношение количеств эритроцитов и вирионов в смеси вируссодержащего материала с суспензией эритроцитов

Рис.53. Агглютинация эритроцитов кур вирусом гриппа. а — титрование вируса: I, II, III — интенсивная агглютинация, обозначаемая тремя и двумя плюсами; IV — слабая агглютинация, обозначаемая одним плюсом; V — отсутствие агглютинации, обозначаемое знаком минус, б — резкая задержка агглютинации при изменении их объемов не изменяется, значит, не изменяется и число ГАЕ.

Феномен гемагглютинации довольно часто используют для очистки вирусов. Многие из них адсорбируются на эритроцитах при 4 °С, а элюируются при 37 °С и, наоборот. Вирусную суспензию смешивают с эритроцитами при температуре, оптимальной для адсорбции, затем агглютинат центрифугируют и промывают. В дальнейшем изменяют температуру и вирус элюируется с поверхности эритроцитов. В результате получают суспензию вируса, относительно свободную от сопутствующего материала.

Реакцию гемадсорбции целесообразно ставить с целью обнаружения (до проявления или при слабо выраженном ЦПД) в инфицированной культуре клеток вируса, обладающего гемагглютинирующей способностью.

Гемадсорбция — соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток. Сущность реакции заключается в том, что на поверхности клеток, инфицированных гемагглютини-рующим вирусом, адсорбируются эритроциты, чувствительные к нему. Так, например, на клетках, инфицированных вирусом па-рагриппа-3, адсорбируются эритроциты морской свинки, вирусом гриппа — эритроциты кур и т.д.

Компонентами реакции служат культура клеток в пробирках в норме и инфицированная, а также 0,4%-ная взвесь эритроцитов, приготовленная на физиологическом растворе или растворе Хенкса.

Методика реакции состоит в следующем. Из пробирок с культурой клеток, инфицированных и неинфицированных (контроль),

контроль эритроцитов для исключения возможности спонтанной гемагглютинации. Для этого к 0,1 мл физиологического раствора добавляют 0,1 мл 0,5...1%-ной взвеси эритроцитов. Панели встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30...60 мин (табл.6).

Рис.54. Реакция гемадсорбции: 1 — островковый тип адсорбции эритроцитов на зараженных клетках; 2 — незараженные клетки

случае можно использовать суспензию вирусвакцины против Ньюкаслской болезни (более отчетливые результаты в РГА дает штамм Н).

Затем следует объяснение преподавателя. После объяснения студенты по подгруппам ставят реакцию гемадсорбции и производят учет РГА и реакции гемадсорбции. Переписывание схемы постановки РГА студентами способствует лучшему ее осмыслению и запоминанию.

Вопросы домашнего задания

1. Возбудитель лейкоза кур и крупного рогатого скота.

2. Сущность РЗГА и задержки гемадсорбции.

ЗАНЯТИЕ 15. Реакция задержки (торможения) гемагглютинации (РЗГА, РТГА) и задержки гемадсорбции (РЗГАд)

Цель занятия: изучить сущность, технику постановки РЗГА (РТГА) и реакции задержки гемадсорбции.

Оборудование и материалы: вирус Ньюкаслской болезни с известным титром, определенным на предыдущем занятии, сыворотка крови кролика, иммунизированного вирусом Ньюкаслской болезни, физиологический раствор, 0,4...1%-ная суспензия эритроцитов кур, пластиковые панели с лунками, пипеточные дозаторы, пипетки градуированные на 1 мл, резиновые груши, аппарат Киппа, культура клеток, инфицированная вирусом, клеточный монослой в норме, таблицы по теме.

./"      Краткие теоретические сведения

Серологические (serum — сыворотка крови) реакции при изучении вирусов и диагностике вирусных инфекций приобретают все большее значение. В связи с достигнутыми в последние годы успехами в приготовлении высокоочищенных антигенов, иммунных сывороток, совершенствовании самой техники постановки серологических реакций повысилась их специфичность и чувствительность. Вскоре после открытия РГА было установлено, что противовирусные сыворотки, соединенные с соответствующим вирусом, способны нейтрализовать его гемагглютинирующую активность, т.е. задерживать процесс гемагглютинации. Одной из простейших серологических реакций является реакция задержки (РЗГА) или торможения (РТГА) гемагглютинации.

РЗГА (РТГА) — высокоспецифическая серологическая реакция, позволяющая решить следующие задачи: определить титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известней сыворотке; установить степень антигенного родства двух гемагт-лютинирующих вирусов. РЗГА широко используют для ретроспективной диагностики некоторых вирусных инфекций (грипп,

удаляют питательную среду (можно без удаления) и вносят 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов, способных агтлютинироваться предполагаемым вирусом. Затем штатив с пробирками встряхивают и оставляют в наклонном положении, полосой вверх, при комнатной температуре или помещают в рефрижератор, длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубации и вида вируса. Так, гемадсорбция с респираторными вирусами при комнатной температуре наступает через 3...5 мин, а при 4 °С — через 30...50 мин.

Учет реакции гемадсорбции проводят при малом увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания или вращения пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов

-■    — ------------- от поверхности клеток. При

вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксируются на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного промывания. На клетках, пораженных вирусом, эритроциты адсорбируются в виде островков или диффузно (ост-ровковый и диффузный тип адсорбции) (рис.54). При отрицательной реакции адсорбция эритроцитов на культуре клеток не наступает, и они свободно плавают в поле зрения микроскопа. В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Ознакомиться с компонентами РГА и гемадсорбции.'

2. Поставить и учесть результат РГА.

3. Поставить и учесть результаты положительной и отрицательной реакции гемадсорбции под микроскопом.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация компонентов РГА и гемадсорбции.

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания Время занятия целесообразно распределить следующим обрезом: вначале самостоятельная работа студентов по постановке РГА. При выполнении данной работы группу делят на подгруппы в зависимости от наличия на кафедре материальных средств. Для постановки РГА целесообразно использовать вирус Ньюкаслской болезни (аллантоисная жидкость куриных эмбрионов, зараженных этим вирусом на занятии по куриным эмбрионам). В крайнем

парагрипп КРС, вирусный аборт овец и др.)- Для этого используют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 2...3 недели, и по приросту титра антител в 4 и более раз определяют заболевание.

Достоинства РЗГА: простота техники постановки, быстрота ответа, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток — РЗГА возможна только с гемагглютинирующи-ми вирусами.

Сущность РЗГА заключается в том, что при взаимодействии противовирусной иммунной сыворотки с соответствующими штаммами вируса происходит задержка (торможение) гемагглю-тинирующей способности вируса.

На результат РЗГА влияют неспецифические ингибиторы гемагглютинации, содержащиеся в сыворотках крови. Они обладают способностью вступать в связь с вирусами и тормозить ге-магглютинацию. С целью ликвидации отрицательного влияния ингибиторов на ход реакции их необходимо разрушить (удалить). Для этого используют несколько методов.

1. Простейшим является метод освобождения сывороток от неспецифических ингибиторов с помощью С0₂. С этой целью к одному объему сыворотки добавляют 9 объемов дистиллированной воды. Пропускание углекислоты через цельные или разведенные физиологическим или гипотоническим растворами сыворотки не дает части ингибиторов выпасть в осадок. С0₂ пропускают в течение 5...7 мин из аппарата Киппа до интенсивного помутнения сыворотки. Вместо газообразной углекислоты можно использовать кусочки сухого льда размером с горошину, которые вносят в пробирку с небольшим интервалом, чтобы избежать пенообразования; для освобождения от образовавшихся хлопьев мукополисахари-дов, содержащих неспецифические ингибиторы, пробирки с сывороткой центрифугируют при 1500-2000 об/мин в течение 10...20 мин, надосадочную жидкость отсасывают и для восстановления физиологической концентрации соли добавляют 8,5% -ный раствор натрия хлорида (1:10 объема). Сыворотки, обработанные углекислотой, не требуют прогревания, так как они освобождаются от термостабильных и термолабильных ингибиторов одновременно. Обработка сывороток С0₂ практически не снижает титр специфических антигемагглютининов.