Влияние серотонина и мелатонина на реализацию вызванных ответов скелетных мышц

Автономные (вегетативные) рефлексы обеспечивают реакцию внутренних органов, сосудистой системы на раздражение висцеральных, мышечных, кожных рецепторов. Эти рефлексы отличаются большим латентным периодом (ЛП) двумя фазами реакции: первая — ранняя — возникает с ЛП 7—9 мс и реализуется ограниченным числом сегментов, вторая — поздняя — возникает с большим ЛП — до 21 мс и вовлекает в реакцию практически все сегменты спинного мозга. Поздний компонент вегетативного рефлекса обусловлен вовлечением в него вегетативных центров головного мозга.

Сложной формой рефлекторной деятельности спинного мозга является рефлекс, реализующий произвольное движение. В основе реализации произвольного движения лежит γ-афферентная рефлекторная система. В нее входят пирамидная кора, экстрапирамидная система, α- и γ-мотонейроны спинного мозга, экстра- и интрафузальные волокна мышечного веретена.

 

 

Глава 2.  Материал и методы исследований

2.1. Наркоз и операционные процедуры

Наркоз и операционные процедуры. Опыты проведены на крысах (n= 12) с использованием уретана в дозировке 1 г/кг внутрибрюшинно в условиях «острого опыта». Опыты были проведены на белых крысах массой 250-300 г. Уретановый наркоз использовался, так как тиопентал и нембутал вызывают снижение возбудимости мотонейронов [16]

Контролировалась глубокая температура тела с помощью электронного термометра и состояние животных (частота и глубина дыхания). Для поддержания жизнедеятельности тканей теплокровных животных использовался раствор Рингера.

Раствор Рингера не только изотоничен плазме крови, но и близок ей по своему ионному составу. Кроме того, его реакция приближается к слабо щелочной реакции плазмы благодаря содержанию в нем NaHCO3 [6].

2.2. Электроды и регистрация физиологических  показателей

Отведения Н- и М- ответов проводили игольчатыми электродами. Активный электрод располагали в мышцах подошвенной поверхности стопы, референтный вводили подкожно в фаланги пальцев стопы, заземляющий располагали в мягких тканях стопы на контрлатеральной конечности. Для выполнения стимуляции веточки большеберцового нерва медиального подошвенного нерва (n. plantaris medialis) стимулирующий электрод  (межэлектродное расстояние 3 мм) приводился в контакт с мягкими тканями над сосудисто-нервным пучком в области медиальной лодыжки. Напряжение стимулов (прямоугольные импульсы длительностью 0,1 мс, частота 0,1 Гц)  плавно увеличивалось от 0 В до получения максимальных ответов (H- и М-). С целью гарантированного охвата всех функционирующих двигательных единиц мышцы использовали супрамаксимальное раздражение, т.е. увеличение интенсивности раздражения после достижения максимального M-ответа еще на 25-30% [6]. Анализировали пороги ответов (В), максимальную амплитуду Н- и М-ответов (мкВ, от негативного до позитивного пиков), латентный период (мс) в течение многочасового опыта. Для выяснения внутрисегментарных нейрохимических механизмов, контролирующих рефлекторную активность мотонейронов, запись вызванных потенциалов выполнялась также и после введения серотонина, мелатонина и контрольных растворов под оболочки спинного мозга и внутривенно.

2.3. Введение контрольных  растворов, серотонина и мелатонин

Фармакологические препараты. В опытах использованы препараты: раствор серотонина (1мг), мелатонина (10 мг/кг внутривенно и 250 мкг объемом 20 мкл интратекально).

Для проведения контрольных исследований и растворения препаратов использован 0,9% раствор NaCl,

Интратекальное введение препаратов. Для инфузии фармакологических препаратов в ликвороносное пространство подопытных животных, применяли метод интратекального введения [18]. После разреза кожи вентральной поверхности шеи и ретракции шейных мышц, отводили в сторону трахею и пищевод распатором, обнажали вентральную поверхность черепа и позвоночника. Через отверстие в атланто-окципитальной мембране аккуратно вводили в каудальном направлении полиэтиленовый катетер (dвн=0,5 мм, dнар=1 мм), продвигая его конец в субарахноидальное пространство до уровня Th8-Th13. Успешность введения контролировалась по отсутствию крови в катетере и воспроизведению нормальной частоты дыхания. Инъекции растворов осуществляли с помощью микрошприца (0,5 мл, «Hamilton», США).

 

 

Глава 3. Результаты исследования

 

3.1. Реализация  Н-ответов в острых опытах на  наркотизированных животных в  контроле

В проведенных сериях опытов (n=12) установлено, что динамика возникновения и развития вызванных Н- и М-ответов мышц задних конечностей (mm. plantaris) у крыс (рисунок 1 ) при постепенном увеличении интенсивности раздражающего стимула была типичной для всех млекопитающих.

Н-рефлекс, регистрируемый в острых опытах на наркотизированных животных, появлялся при интенсивности раздражения (0,7±0,08 В) подпороговой для М-ответа. По мере возрастания амплитуды Н-рефлекса появлялся пороговый М-ответ (1,1±0,09 В), что соответствует данным, описанным в литературе. Затем амплитуда рефлекторного Н-ответа достигала максимума (3850±290 мкВ) при интенсивности тока 3,0±0,3 В. М-ответ достигал максимального (7450±410 мкВ)  при 4,1±0,4 В. Латентные периоды Н-ответа (0,9±0,5 мс) и М-ответа (0,25±0,06 мс) были стабильными  для отдельной особи, в том числе после введения NaCl 0,9% и нейроактивных препаратов. С увеличением силы стимулов и амплитуды M-ответа у людей [3] наблюдается постепенное угнетение Н-ответа до его полного подавления. Угнетение Н-рефлекса в руководствах по электронейромиографии [3]. Во-первых, полагают, что по мере увеличения интенсивности раздражения происходит активация низкопороговых двигательных волокон и импульс, распространяясь, в том числе и антидромно, создает феномен «коллизии», препятствуя, таким образом, возбуждению мотонейронов. Во-вторых, согласно тому же источнику, угасание Н-ответа в процессе увеличения интенсивности раздражающих стимулов, которые субъективно воспринимаются как болевые, объясняется включением интрасегментарных и супрасегментарных тормозных процессов (например пресинаптического торможения IА афферентов). У наркотизированных крыс полного подавления Н-рефлекса не наблюдалось даже  при максимальном напряжении тока (6,5 В) во всех опытах.

 

а	Б
Рисунок 1 − Развитие Н- и М-ответов, зарегистрированных в мышцах подошвенной поверхности стопы (mm. plantaris) крысы до и после интратекального введения 20 мкл 0,9% раствора NaCl.

 

Динамика развития вызванных ответов, как и электрофизиологические показатели Н- и М-ответов (порог, максимальная амплитуда, латентный период, длительность ответов) после введения 0,9% раствора NaCl под оболочки спинного мозга, значимо не отличались от фона (рисунок 1 а и б).

 

 

3.2. Реализация Н-ответов в острых опытах на наркотизированных крысах после внутривенного и интратекального введения 5-гидрокситриптамина

 

В серии острых опытов (n=8) регистрировали Н- и М-ответы до и после введения 5-НТ в ликвороносное пространство спинного мозга (n=4; 50 мкг раствора объемом 20 мкл) и внутривенно (n=4; 4 мг/кг) (таблица 1).

 

Таблица 1 – Электрофизиологические показатели Н-рефлекса и М-ответа мышц подошвенной поверхности стопы крысы до и после введения 0,9% раствора NaCl и 5-гидрокситриптамина в субарахноидальное пространство и внутривенно

 

Условия регистрации	Порог Н-рефлекса, В	Порог М-ответа, В	Амплитуда Н-рефлекса, мкВ	Амплитуда М-ответа, мкВ
До введения	0,8±0,08	1,1±0,09	3850±290	7450±410
После внутривенного введения  5-НТ	0,8±0,09	1,1±0,1	3100±310 *	7400±380
После интратекального введения  0,9% NaCl	0,8±0,08	1,1±0,09	3900±260	7460±430
После интратекального введения 5-НТ	0,8±0,07	1,1±0,08	3000 ±400 *	7490±360

(*) –  достоверное изменение электрофизиологического показателя по сравнению с фоном и контролем (P<0,05)

 

При внутривенном введении серотонина, как и при интратекальном отмечалось достоверное снижение амплитуды Н-рефлекса во всех опытах (таблица 1).  Изменения амплитуды М-ответа не отмечалось.

Максимальная реакция развивалась к 3 минуте при введении вещества под оболочки спинного мозга и к 5 минуте после внутривенной инъекции.

Пороги возникновения Н- и М-ответов были стабильными независимо от воздействия.

Таким образом, полученные данные экспериментов свидетельствуют, что оба способа введения серотонина, в данных методических условиях, приводили к снижению амплитуды Н-рефлекса на 20-22% против фона. Поскольку величина амплитуды отражает количество возбужденных двигательных единиц, то, следует предположить, что в условиях увеличения концентрации серотонина в ликвороносном пространстве происходит торможение части соматических мотонейронов.

 

3.3. Реализация Н-ответов в острых опытах на наркотизированных крысах после внутривенного и интратекального введения мелатонина

 

В серии острых опытов (n=4) регистрировали Н- и М-ответы до и после введения мелатонина в ликвороносное пространство спинного мозга (n=4; 250 мкг раствора объемом 20 мкл) и внутривенно (n=4; 10 мг/кг) (таблица 2).

 

Таблица 2 – Пороги Н-рефлекса и М-ответа мышц подошвенной поверхности стопы крысы до и после введения 0,9% раствора NaCl и мелатонина в субарахноидальное пространство и внутривенно

 

Вызванные ответы	до введения	0,9% NaCl	через 5 мин после инъекции	через 30 мин после инъекции
Интратекальное	введение
Н-рефлекс	0,7±0,08	0,7±0,09	0,6±0,1	0,7±0,1
М-ответ	0,9±0,07	0,9±0,1	0,9±0,09	0,9±0,1
Внутривенное	введение
Н-рефлекс	0,7±0,1	0,6±0,09	0,5±0,07	0,5±0,1
М-ответ	0,8±0,09	0,8±0,09	0,8±0,08	0,8±0,09

 

Оба способа введения мелатонина не привели к значимым изменениям порогов вызванных ответов мышц задней конечности крысы.

Амплитуда вызванных ответов мышц подошвенной поверхности стопы также изменялась несущественно после введения мелатонина, как в ликвороносное пространство спинного мозга, так и после внутривенной инъекции (таблица 3)

Однако нами была отмечена тенденция к уменьшению амплитуды Н-рефлекса к 30-ой минуте после внутривенного введения мелатонина.

Таблица 3 – Амплитуда Н-рефлекса и М-ответа мышц подошвенной поверхности стопы крысы до и после введения 0,9% раствора NaCl и мелатонина в субарахноидальное пространство и внутривенно

 

Вызванные ответы	до введения	0,9% NaCl	через 5 мин после инъекции	через 30 мин после инъекции
Интратекальное	введение
Н-рефлекс	3600±290	3660±310	3700±340	3700±320
М-ответ	6800±350	6760±340	6700±340	6740±330
Внутривенное	введение
Н-рефлекс	3700±310	3690±280	3550±330	3420±340
М-ответ	6820±360	6780±370	6760±380	6790±350

 

Латентный период, как и длительность ответов оставались стабильными не зависимо от оказываемого воздействия в острых опытах.

Таким образом, полученные результаты данной серии экспериментов свидетельствуют, что оба способа введения мелатонина, в данных методических условиях, не отражались на реализации вызванных ответов мышц задней конечности крысы. Следует предположить, что либо мелатонин не участвует в регуляции возбудимости сегментарных соматических мотонейронов, либо используемая доза препарата была не эффективна.