Диагностика микоплазма – инфекции культуральным методом

Имеет широкий спектр действия, включающий грамположительные аэробные микроорганизмы, грамотрицательные микроорганизмы  и также некоторые грибы и анаэробы. Активность может быть снижена в связи с распространением устойчивых штаммов [16, 17, 23].

• Азитромицин – антибактериальное средство широкого спектра действия, азалид, действует бактериостатически. После приёма его концентрация в тканях и клетках в 10 – 50 раз выше, чем в крови. Способность препарата накапливаться преимущественно в фагоцитах особенно важна для подавления внутриклеточных возбудителей инфекции. Установлено, что фагоциты доставляют этот антибиотик в места инфекции, где и освобождает его в процессе фагоцитоза. Концентрация азитромицина в очагах инфекции значительно выше, чем в здоровых тканях и, что особенно ценно, коррелирует со степенью воспалительного отёка [12]. В клетках и тканях антибиотик связывается с 50S-субъединицей рибосом, угнетает пептидтранслоказу на стадии трансляции, подавляет синтез белка, замедляет рост и размножение бактерий, в высоких концентрациях оказывает бактерицидный эффект. Действует на вне- и внутриклеточных возбудителей [16, 17, 23, 24].
• Кларитромицин – полусинтетический макролидный антибиотик широкого спектра действия. Нарушает синтез белка микроорганизмов (связывается с 50S-субъединицей рибосом бактериальной клетки). Действует на вне- и внутриклеточно расположенных возбудителей [16, 17, 23].
• Эритромицин – бактериостатический антибиотик из группы макролидов, обратимо связывается с 50S-субъединицей рибосом, что нарушает образование пептидных связей между молекулами аминокислот и блокирует синтез белков микроорганизмов (не влияет на синтез нуклеиновых кислот). Антимикробное действие эритромицина направлено, главным образом, на пролиферирующие клетки. На не размножающиеся микроорганизмы антибиотик действует слабо [16,17, 23].
• Пристиномицин – антибиотик системного действия из группы макролидов. Спектр действия подобен эритромицину, активность его в отношении грам+ бактерий выше, устойчивые формы бактерий встречаются реже. Подавляет метициллинрезистентные стафилококки [16, 17, 23].

 

 

3. Фторхинолонам:

• Ципрофлоксацин – противомикробное средство широкого спектра действия, производное фторхинолона, подавляет бактериальную ДНК-гиразу (топоизомеразы II и IV, ответственные за процесс суперспирализации хромосомной ДНК вокруг ядерной РНК, что необходимо для считывания генетической информации), нарушает синтез ДНК, рост и деление бактерий; вызывает выраженные морфологические изменения (в том числе клеточной стенки и мембран) и быструю гибель бактериальной клетки. Действует бактерицидно на грамотрицательные организмы в период покоя и деления (так как влияет не только на ДНК-гиразу, но и вызывает лизис клеточной стенки), на грамположительные микроорганизмы — только в период деления. Низкая токсичность для клеток макроорганизма объясняется отсутствием в них ДНК-гиразы. К препарату резистентны: Bacteroides fragilis, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas maltophilia, Ureaplasma urealyticum, Clostridium difficile, Nocardia asteroides. Не эффективен в отношении Treponema pallidum. Резистентность развивается крайне медленно, поскольку, с одной стороны, после действия ципрофлоксацина практически не остается персистирующих микроорганизмов, а с другой — у бактериальных клеток нет ферментов, инактивирующих его [23].
• Офлоксацин – противомикробное средство широкого спектра действия из группы фторхинолонов, оказывает бактерицидный эффект. Действует на бактериальный фермент ДНК-гиразу, обеспечивающую сверхспирализацию и, таким образом, стабильность ДНК бактерий (дестабилизация цепей ДНК приводит к гибели микроорганизмов).

Активен в отношении микроорганизмов, продуцирующих бета-лактамазы и быстрорастущих атипичных микобактерий [23].

Урогенитальные микоплазмы различных видов имеют уникальные внутриклеточные ферментные системы, позволяющие индифицировать их. Так           M. hominis способны гидролизовать аргинин с помощью трех ферментов (аргининдезаминазы, орнитинтранскарбамилазы и карбаматкиназы) до аммиака.     U. urealiticum гидролизует мочевину с помощью уреазы также до аммиака. Эта способность урогенитальных микоплазм защелачивать или закислять жидкую питательную среду позволяет проводить оценку результатов анализа на микоплазмоз и уреаплазмоз визуально по изменению цвета рН-индикатора в процессе роста микоплазм и уреаплазм. рН-индикаторы входят в состав жидких питательных сред для обнаружения и индикации урогенитальных микоплазм, а также используется в тест-системах для определения антибиотикочувствительности возбудителей уреаплазмоза и микоплазмоза.

2.2 Исследуемый материал

В качестве исследуемого материала  использовали соскобы из уретры, эндоцервикального канала и влагалища 100 пациентов г. Минска детородного возраста (женщины 19–44 лет, мужчины — 27–41 год). Доставленные флаконы с внесенными в них образцами тщательно перемешивали и переносили 3мл раствора во флаконы с лиофилизированным субстратом. Встряхивали на вортексе до полного растворения лиофилинизированного субстрата. 55µл полученной суспензии вносили в подготовленные стрипы при комнатной температуре. Для создания бескислородной среды добавляли по две капли минерального масла в каждую лунку [25].

2.3 Инкубация

Стрипы и остатки суспензии во флаконе инкубировали при температуре 36ºС±2ºС в течение 24 и 48 часов.

2.4 Учет и интерпретация результатов

Учет результатов  проводили через 24 часа и через 48 часов инкубации. При наличии роста в среде, специфические субстраты (мочевина для Ureaplasma spp. и аргинин для М. hominis) и индикатор (феноловый красный) меняли цвет в результате изменения рН с желтого на малиново-красный (Рисунок 2.1).

 

 

Рисунок 2.1 – Изменение  цвета в мочевинно-аргининовам бульоне.

 

Полученные результаты заносили в бланк для учета  результатов («+» при изменении  цвета, «-» при отсутствии изменения цвета) (таблица 2.1).

 

Таблица 2.1 – Результаты

	Идентификация			Титр		Чувствительность к антибиотикам
						DOT		JOS		OFL		ERY		TET		CIP		AZI		CLA		PRI
	0	Uu	Mh	Uu	Mh	4	8	2	8	1	4	1	4	4	8	1	2	0.12	4	1	4	2
24ч	+	+	-	+	-	-	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-
48ч	+	+	-	-+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-

2.5 Принцип метода

Принцип метода основан  на ингибировании антибиотиками  метаболической активности урогенитальных микоплазм в жидких питательных средах. В процессе роста урогенитальных микоплазм в cредах образуются щелочные или кислые продукты метаболизма, что проявляется в изменении цвета индикатора (рисунок 2.2).

 

Рисунок 2.2 – Стрип с антибиотикограммой

 

В 18 лунках сорбированы  антибиотики. После внесения в эти  лунки питательной среды с исследуемой пробой сорбированные антибиотики растворялись в среде. В тех лунках, где антибиотики подавляли рост урогенитальных микоплазм, изменение среды не происходило и штамм считался чувствительным к данным антибиотикам. В тех лунках, где антибиотики не подавляли рост урогенитальных микоплазм, происходило изменение цвета среды с желтого на малиновый и штамм считался резистентным к данным антибиотикам.

Концентрации антибиотиков подобраны таким образом, чтобы  профиль чувствительности исследуемых  штаммов определялся как чувствительный (Sensitive), умеренно устойчивый или резистентный (Resistant).

2.6 Статистическая обработка данных

Полученные данные обрабатывали при помощи электронных таблиц Microsoft office Excel 2003 и пакета программ Statistica 8.0. Для интегральной характеристики лекарственной устойчивости использовали термин «нечувствительные» штаммы, объединяющий умеренно резистентные и резистентные микроорганизмы. Для обработки данных  использовались непараметрические методы. Для выявления достоверности различий в группах с моно и смешанной микоплазменной инфекцией использовался критерий χ2 с поправкой Йетса. Во всех случаях принимали уровень значимости, равный 0,05 [26].

 

3 Результаты и обсуждения

3.1 Выявления М. hominis и U.urealiticum

В исследованиях были использованы соскобы из уретры, эндоцервикального канала и влагалища 100 пациентов г. Минска детородного возраста (женщины 19–44 лет, мужчины — 27–41 год). Результаты снимали по наличию роста в среде. При положительном результате специфические субстраты (мочевина для U.urealiticum и аргинин для М. hominis) и индикатор (феноловый красный) меняли цвет в результате изменения рН с желтого на малиново-красный.

В результате проведенных  исследований среди 100 пациентов с  хроническими инфекциями мочеполовой системы урогенитальный микоплазмоз и уреаплазмоз был выявлен у 47% человек. У 53% результат оказался отрицательным. Вследствие этого можно предполагать, что заболевания мочеполовой системы у 53% пациентов не связаны с микоплазменной и уреаплазменной инфекцией (рисунок 3.1).

 

Рисунок 3.1 – Выявление  M.hominis и U.urealiticum при различных патологических процессах

 

Урогенитальная моноинфекция была выявлена у 24 (51,06%) пациентов исследуемой группы (Рисунок 3.2). Из них у 17 (36,17%) был выявлен уреаплазмоз в высоких титрах (≥10⁴ КОЕ). Низкий титр ≤ 10⁴ КОЕ у 7 (14,89%) говорит о возможном существовании скрытой, бессимптомной формы заболевания, при котором, в основном женщины, являются носителями уреаплазм. M.hominis в виде моноинфекции выявлено не было.

Уреаплазмы и микоплазмы редко существуют в виде моноинфекции (для U.urealiticum 1,6 – 37,5%, M.hominis 2 – 3,2%). Поэтому выявленная моноинфекция может быть ассоциирована с факультативно-анаэробными микроорганизмами, хламидиями или вирусами.

 

Рисунок 3.2 – Выявление  урогенитальной моноинфекции у пациентов с хроническим заболеванием мочеполовой системы.

 

В результате проведенных  исследований был установлен высокий  процент случаев ассоциированного выявления U.urealiticum с M.hominis - 23 (48,94%) пациента (Рисунок 3.3). Причины такой ассоциации в литературе не описаны.

 

Рисунок 3.3 – Выявление моно- и смешанной инфекции у пациентов с хроническим заболеванием мочеполовой системы

3.2 Определение чувствительности к  антибиотикам

Специфическая характеристика M. hominis и U. urealitycum, определяющая их природную резистентность к антибиотикам, является отсутствие у них клеточной стенки, в результате чего микоплазмы устойчивы ко всем препаратам, действие которых связано с биосинтезом белков клеточной стенки. К этой группе в первую очередь относятся пенициллины. Чувствительны же микоплазмы к ингибиторам синтеза мембранных и внутрицитоплазматических белков [2].

Большинство из микоплазм  чувствительны к антибиотикам тетрациклинового ряда, многим макролидам, линкозамидам, противогрибковым и противопротозойным препаратам. Также они проявляют чувствительность к группе фторхинолонов (синтетических препаратов, действие которых направлено на подавление активности топоизомераз микроорганизмов) [2].

Однако некоторые препараты  обладают различной активностью  по отношению к разным видам микоплазм, поэтому требуется информация об антибиотикоустойчивости штаммов. Особенно это касается генитальных видов микоплазм. Большинство микоплазменных инфекций могут быть излечены соответствующими антибиотиками. Трудности могут возникать при лечении больных с иммунодефицитом [2,5].

Поэтому целью нашего лабораторного исследования чувствительности бактерий к антибиотикам явилась идентификация возбудителей, вызывающих инфекционные заболевания, и установление их чувствительности или устойчивости к антибактериальным средствам, используемым по общепринятым схемам терапии.

С помощью тест-системы “Mycoplasma IST 2” (BioMerieux, Франция) была изучена чувствительность микоплазм к 9 антибиотикам: доксициклину, джозамицину, офлоксацину, эритромицину, тетрациклину, ципрофлоксацину, азитромицину, кларитромицину, пристинамицину.

В результате проведенных  нами исследований из 100 обследованных  пациентов у 47 был выявлет урогенитальный микоплазмоз. В 24 (51,06%) случаях из 47 положительных образцов была выращена U. urealitycum как моноинфекция. В остальных 23 (48,94%) образцах была выявлена смешанная инфекция. Во всех случаях выявления возбудителя была поставлена антибиограмма с указанной панелью антибиотиков, определено процентное соотношение чувствительных и резистентных штаммов. 

Совокупные данные о  чувствительности и резистентности уреаплазм и микоплазм представлены в таблицах 3.1 и 3.2.

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 3.1 – Антимикробная чувствительность  моноинфекции U. urealyticum, n=24

Чувствительность	Количество чувствительных пациентов к антибиотикам*
	DOT	JOS	OFL	ERY	TET	CIP	AZI	CLA	PRI
Чувствительны (S)	24	24	6	15	24	2	9	24	24
Резистентны (R)	0	0	18	9	0	22	15	0	0

* DOT – доксициклин, JOS – джозамицин, OFL  - офлоксацин, ERY – эритромицин, TET – тетрациклин, CIP –  ципрофлоксацин, AZI – азитромицин,  CLA – кларитромицин, PRI – пристинамицин.

 

Таблица 3.2 – Антимикробная чувствительность ассоциированной инфекции U. urealyticum с M. hominis, n=23.

Чувствительность	Количество чувствительных пациентов к антибиотикам*
	DOT	JOS	OFL	ERY	TET	CIP	AZI	CLA	PRI
Чувствительны (S)	22	9	3	1	20	1	1	3	23
Резистентны (R)	1	14	20	22	3	22	22	20	0