Биотрансформация иммобилизованными ферментами

Носитель может оказывать существенное влияние на кинетику действия иммобилизованного фермента. Так, необходимо учитывать следующие возможности: внешних и внутренних диффузионных затруднений; стерических препятствий, особенно в  реакциях фермента с макромолекулярными субстратами; распределение субстратов, ингибиторов, ионов водорода и других эффекторов между водным раствором и матрицей (за счет электростатических или гидрофобных взаимодействий, водородных связей).

Некоторые из этих эффектов нежелательны, и с ними приходится бороться [4], подбирая другой носитель или условия иммобилизации. С другой стороны, например, эффекты распределения можно целенаправленно использовать для придания катализатору других свойств. Так, при иммобилизации на анионном полиэлектролите (рис. 3, кривая а) происходит концентрирование ионов гидроксония в зоне отрицательно заряженной матрицы, что вызывает сдвиг локального значения рН, характеризующего микроокружение фермента, в «кислую сторону» по сравнению с раствором. В итоге рН-профиль наблюдаемой каталитической активности оказывается смещенным вправо, т. е. в сторону более высоких значений рН буфера. При иммобилизации на катионном полиэлектролите (рис. 3, кривая б) имеет место прямо противоположная зависимость.

 

Рис. 1. Ковалентное присоединение фермента к полисахаридному носителю.

 

Рис. 2. Сополимеризационный метод для иммобилизации фермента в полимерном геле.

 

Рис. 3. рН-зависимость максимальной скорости гидролиза бензилпенициллина пенициллинамидазой.

а - нативный фермент; комплекс фермента с поликатионом (б) и полианионом (в).

 

Ферменты подвержены опасности «поедания» их микроорганизмами, почти всегда присутствующими в окружающей среде. Этого легко избежать, если фермент экранировать от них, включив его, например, в микропористый носитель. В результате связывания фермента с носителем становятся невозможными (или хотя бы затрудненными) также и различного рода полимолекуляряые инактивационные процессы типа фермент-ферментного взаимодействия, такие, как агрегация или автолиз в случае протеолитических ферментов.

Другой весьма распространенный механизм инактивации ферментов [6] состоит в их денатурации при неблагоприятных условиях внешней среды (повышенная температура, крайние значения рН, органические растворители). Денатурационному разворачиванию ферментной молекулы удается воспрепятствовать, если каталитически активную конформацию искусственно закрепить. Идея некоторых наиболее оправдавших себя принципов представлена на рис. 4 пространственное строение белковой молекулы становится более устойчивым при наложении на нее скобок (проводя внутримолекулярную «сшивку» белка бифункциональными реагентами, см. рис. 4, а), в результате многоточечного ковалентного или нековалентного присоединения фермента к носителю (рис. 4, б) или при механическом включении его в «тесные» поры носителя (рис. 4, в). Таким путем денатурацию (инактивацию) белка удалось замедлить в сотяи, тысячи и миллионы раз (в зависимости от метода стабилизации и природы фермента). Это означает, что, фермент, который, например, при температуре 50°С инактивируется практически мгновенно (рис, 5), будучи стабилизованным, может «работать» при температуре 80° часами или сутками и при более низкой температуре—месяцами.

Удалось также решить задачу как «заставить» ферменты функционировать в органических растворителях с малым содержанием воды. С этой целью применяют двухфазные системы вода - несмешивающийся с водой органический растворитель [16]. Гетерогенную реакционную среду создают обычно как микроэмульсию водного раствора фермента в органической среде или, что гораздо более удобно методически и технологически, как суспензию в органическом растворителе пористых частиц (стекло, керамика и др.), пропитанных водным раствором фермента (рис. 6, а). Весьма важная разновидность подобного рода реакционных сред - это коллоидный раствор воды в органическом растворителе [14]. Здесь фермент, будучи включенным в обращенную мицеллу поверхностно-активного вещества (детергента, липида), функционирует в своеобразном микрореакторе, содержащем всего лишь несколько сот или тысяч молекул воды (рис. 6,6).

 

Рис. 4. Физико-химические принципы, позволяющие закрепить  структуру ферментной, глобулы

а - внутримолекулярная «сшивка»; б - ковалентное или нековалентное  присоединение к носителю; в - механическое включение в «тесные» поры носителя

 

Рис. 5. Температурная  зависимость относительной каталитической активности

1 - химотрипсин, иммобилизованный  в по-лиакриламидном геле по  сополимеризаци-опной методике (см. рис. 2); 2—свободный фермент [37]

 

Рис. 6. Двухфазная система «вода - несмешивающийся с водой органический растворитель» с ферментом, включенным в поры носителя (а), и включение фермента в обращенные мицеллы поверхностно-активного вещества в органическом растворителе (б)

Наряду с созданием научных основ стабилизации ферментов сейчас успешно решаются также и другие проблемы, связанные с продлением их работоспособности, такие, как реактивация денатурированных ферментов и регенерация кофакторов [16].

Основные области  применения иммобилизованных ферментов. Особенно ощутимый вклад иммобилизованные ферменты внесли в тонкий органический синтез, в анализ, в медицину, в процессы конверсии энергии, в пищевую и фармацевтическую промышленность.

Органический синтез [15]. Применение ферментов в органическом синтезе сдерживалось до последнего времени прежде всего тем, что многие органические реагенты плохо растворимы или вообще нерастворимы в воде как классической среде ферментативных реакций. Более того, положение равновесия многих практически важных процессов таково, что нужные продукты могут быть получены с высоким выходом лишь при проведении реакции в органическом растворителе. В этих условиях, однако, ферменты теряют каталитическую активность. Поэтому создание научных основ двухфазного метода (см. рис. 6)  послужило решающим стимулом в развитии ферментативного синтеза. Для синтетической органической химии важно то, что в двухфазных реакционных средах фермент сохраняет каталитическую активность даже при исключительно малом содержании воды (доли процента) и, следовательно, равновесие катализируемой реакции (выход продукта) экспериментатор может регулировать в широких пределах, подбирая нужный, т. е. подходящий для синтеза, органический растворигель.

Иммобилизованные ферменты дали толчок к созданию принципиально новых методов «безреагентного» непрерывного анализа многокомпонентных систем органических (а в ряде случаев и неорганических) соединений. Главное звено в этих методах—«ферментные электроды» и «ферментные термисторы». В будущем важную роль в контроле окружающей среды и в ( клинической диагностике должны сыграть такие методы, как биолюминесцентный анализ [8] и иммуноферментный анализ.

Иммобилизованные ферменты в медицине открыли, во-первых, путь к созданию лекарственных препаратов пролонгированного действия со сниженной токсичностью и аллергентностью [9]. В СССР был создан первый в мире препарат иммобилизованного фермента (стрептокиназа) для парентерального введения при лечении сердечно-сосудистых заболеваний [8, 3]. Во-вторых, иммобилизационные подходы способствуют решению проблемы направленного транспорта лекарств в организме [2].

 

Рис. 8. Технологический  процесс совместного получения  фруктозы и алкен-оксидов.

 

Биоконверсия  энергии и массы. Эти задачи пытаются успешно решать прежде всего микробиологическим путем. Тем не менее иммобилизованные ферменты вносят ощутимый вклад в осуществление биофотолиза воды и в биоэлектрокатализ [6, 8, 10], и с их участием становится реальным создание топливных элементов [10]. Заслуживает внимания также проблема деструкции возобновляемого растительного сырья, прежде всего расщепление лигниноцеллюлозных материалов [8].

Искусственные ферментативные усилители слабых сигналов. На активный центр иммобилизованного фермента удается действовать через носитель, подвергая последний механическим нагрузкам, ультразвуковой обработке или фотохимическим превращениям. Это позволяет регулировать каталитическую активность системы фермент—носитель под действием механических [5], ультразвуковых [9] и световых [7, 17] сигналов. На этой основе были созданы механо- и звукочувствительные датчики [9] и открыт путь к бессеребряной фотографии [13].

Идея как получить изображение с помощью метода иммобилизации ферментов, исключительно проста (рис. 7). функциональные группы  исходного носителя (подложки) не должны взаимодействовать с ферментом, однако под действием света они претерпевают химическое превращение    (К-»Х) с образованием фрагментов, у которых появилась способность химически связывать фермент или его сорбировать. Таким образом, фермент  оказывается иммобилизованным на поверхности подложки именно в тех местах, куда попал свет, а в неосвещенном участке его не будет. Иными словами, в результате фотоиммобилизации фермента возникает «скрытое изображение». «Пришитый» фермент можно визуализовать, если подложку обработать раствором субстрата, который под действием света превращается в окрашенный продукт. В принципе при проявлении подложки субстратом каждая молекула фотоиммобилизованного фермента нарабатывает миллионы молекул окрашенного продукта (каталитический эффект усиления первичного сигнала), тем самым скрытое изображение становится видимым невооруженным глазом. В отличие от других ферментативных фотографических процессов [3] фотоиммобилизационный метод [27] весьма универсален, поскольку реализация его фактически не зависит от природы фермента.

Промышленные  процессы. Технологические процессы с применением иммобилизованных ферментов внедрены прежде всего в пищевую и фармацевтическую промышленность. Главная мысль, которую нам хотелось бы здесь подчеркнуть, заключается в том, что биокатализ начинает стирать привычные границы между пищевыми и органосинтетическими технологиями. Наглядный пример — процесс совместного получения фруктозы и окислов алкенов, который разрабатывает фирма “CETUS Corporation” в США (рис. 8). На первой стадии проводят окисление D-глюкозы до D-глюкозона под действием иммобилизованной пиранозо-2-оксидазы; на второй стадии под действием водорода на палладиевом катализаторе полученный глюкозой восстанавливают со 100%-ным выходом до D-фруктозы. Побочный продукт первой стадии (перекись водорода) D-используется для микробиологического окисления этилена или пропилена до соответствующих эпоксидов. Как видно, в данном процессе слились три синтетических метода: ферментативный (стадия 1), химический (стадия 2) и микробиологический (стадия 3). Этот процесс, наполовину пищевой (фруктоза), наполовину органосинтетический (эпоксиды), можно считать предвестником будущих, еще более совершенных, т. е. комплексных и безотходных, биотехнологий.

 

 

Применение иммобилизованных ферментов  в пищевой промышленности

 

 

Использование биологических  процессов и агентов для получения пищевых продуктов и улучшения их качества - древнейшая ветвь биотехнологии. Скорее, это ее корни. Примеры в этом отношении общеизвестны — получение молока, изготовление вин, уксуса, пивоварение, сыроделие, хлебопечение и т. д. Во всех этих процессах в качестве биологических агентов выступали и продолжают выступать биологические организмы - от диких и домашних животных до микроорганизмов.

История пищевых технологий насчитывает тысячелетия, и тем  не менее совершенствование их продолжается не только неослабевающими, но даже возрастающими темпами. Масштабы современных исследований и разработок в области традиционных технологий пищевых продуктов огромны. Однако в последнее время наметились перспективы принципиального сдвига в технологиях получения и улучшения качества, пищевых продуктов: разработки в этой области стали переходить от использования целых биологических организмов на клеточный и молекулярный уровни [5].

Как известно, все живые  организмы содержат большое количество (сотни и тысячи) ферментов, основная функция которых состоит в проведении, ускорении и регуляции практически всех химических реакций, необходимых для жизнедеятельности организма. Благодаря высокой активности и специфичности некоторые ферменты уже давно нашли применение в ряде областей промышленности:

Ферменты                   Области использования

Гликозидазы

-амилаза Хлебопечение

» Пивоварение

» Производство кондитерских изделий

» Обработка текстильных изделий

» Производство высококачественной бумаги

глюкоамилаза Получение глюкозы

» Осахаривание ликеров и пива

инвертаза Производство кондитерских изделий лактаза Производство мороженого пектиназы Производство и осветление вин и фруктовых соков

» Производство кофе

целлюлазы Облагораживание растительных кормов

» Приготовление морковных джемов

» Обработка цитрусовых

Протеазы

протеазы микробного

происхождения     Размягчение мяса

» Добавки к детергентам

» Обработка текстильных изделий

» Хлебопечение

» Осветление вин и пива

» Стабилизация сгущенного молока

» Выделка кож

бромелаин Размягчение мяса

 » Стабилизация пива

папаин Осветление пива

» Получение белковых гидролизатов молока

» Размягчение мяса

фицин Размягчение мяса

трипсин Выделка кож

реннин Сыроделие

пепсин Сыроделие

» Стабилизация пива

Липазы Модификация вкуса молочных продуктов

» Сыроделие

Оксидоредуктазы Производство кондитерских изделий

» Выделка кож

глюкозооксидаза Удаление кислорода и/или глюкозы из пи- 
 щевых продуктов

» Пивоварение

» Приготовление майонезов

каталаза Удаление перекиси водорода после стерили- 
    зации молочных продуктов, после отбелива-

ния тканей, кожи,древесины  и т. д.

Изомеразы 

глюкозоизомераза Производство глюкозо-фруктозных сиропов

 

В основном, как видно, это относится к пищевой промышленности, где применяются главным образом малоочищенные комплексные ферментные препараты для гидролиза природных полимеров — белков, крахмала, пектинов.

В последние полтора-два  десятилетия определились пути расширения областей применения ферментов. Они  связаны с получением так называемых иммобилизованных ферментов, а также иммобилизованных клеток микроорганизмов [2]. Сочетание уникальных каталитических свойств ферментов с их водонерастворимостью в иммобилизованном виде послужило основой для создания ряда новых технологических процессов [4]. Эти процессы в настоящее время применяются главным образом в производстве пищевых продуктов.

К настоящему времени шесть процессов с использованием иммобилизованных ферментов или клеток нашли крупномасштабное применение в пищевой промышленности ряда развитых стран мира.

1. Получение глюкозо-фруктозных  сиропов и далее фруктозы из  глюкозы.

2. Получение оптически активных D-аминокислот из их рацемических смесей.