Антибиотическое действие экстракта лишайника Hypogymnia physodes

 На основании  различий полисахаридного состава  были, например, дифференцированы роды  пармелиоидных лишайников светло-зеленого  цвета. Было показано, что Psiloparmelia и Flavoparmelia содержат изолихенан, Arctoparmelia – лихенан Cetraria-типа, а Xanthoparmelia – лихенан Xanthoparmelia-типа [26,28].

 

1.5 Характеристика молочнокислых бактерий

 

Молочнокислые бактерии относятся к семействам Lactobacillaceae и Streptococcaceae. Расположение в природе молочнокислых бактерий определяется их сложными потребностями в питательных веществах и способом получения энергии. Они почти никогда не обнаруживаются в почве или водоемах [29].

В естественных условиях они встречаются:

• в молоке, молочных продуктах, в местах переработки молока (Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis и другие лактобациллы; Streptococcus lactis);
• на поверхности растений как эпифитная микрофлора и на разлагающихся растительных остатках (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc menenteroides);
• в кишечнике и на слизистых оболочках человека и животных как представители нормальной микрофдоры (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum, Streptococcus bovis и другие) [30].

В связи с  тем, что молочнокислые бактерии используются для приготовления пищевых продуктов и выступают как возбудители болезней человека и животных, они представляют собой группу большого экономического значения. Это морфологически гетерогенная группа бактерий, она включает палочковидные и сферические организмы, длиной от 0,7 – 1,1 до 3,0 – 8,0 мкм, расположенных единично или собранных в цепочки. Все молочнокислые бактерии грамположительны, не образуют эндоспор (за исключением Sporolactobacillus inilinus), капсул, и в подавляющем большинстве неподвижны. Форма и длина клеток у различных культур одних и тех же видов молочнокислых бактерий часто зависит от состава среды, присутствия кислорода и способа культивирования [31].

 Это факультативные анаэробы, использующие в качестве источника энергии углеводы и образующие в качестве основного продукта брожения молочную кислоту (по этому признаку их объединяют в отдельную обширную группу микроорганизмов). У всех молочнокислых бактерий обнаруживаются сложные потребности в факторах роста: витаминах группы В, аминокислотах, пуринах и пиримидинах. Отличительная физиологическая особенность молочнокислых бактерий – их высокая устойчивость к молочной кислоте, что является следствием характерного для них энергетического метаболизма [32].

 Способность молочнокислых бактерий образовывать и переносить довольно высокие концентрации молочной кислоты имеет важное селективное значение, так как такое свойство дает им возможность успешно конкурировать с большинством других бактерий в средах, богатых питательными веществами. Молочнокислые бактерии обычно способны только к брожению. В зависимости от того, какие молочнокислые бактерии вызывают брожение и какие при этом образуются продукты, они бывает двух типов типичными, или гомоферментативными, инетипичными, или гетероферментативными. К числу наиболее часто встречающихся типичных гомоферментативных молочнокислых бактерий относится молочный стрептококк (Streptococcus lactis). В молодых культурах он представляет собой типичный стрептококк, образующий цепочки различной длины из овальных клеток диаметром 0,5 – 1,0 мкм. В старых культурах после свертывания молока преобладают сочетания в виде диплококков. Встречается он и в виде коротких бесспоровых палочек, окрашивающихся положительно по Граму [33].

 Колонии  молочного стрептококка на поверхности твердой питательной среды мелкие, выпуклые, слегка беловатые, напоминающие капли воды или жира. У Streptococcus cremoris клетки расположены более длинными цепочками [34].

Lactobacillus bulgaricus – крупная палочка длиной 4 – 5 мкм, неподвижная, грамположительная, располагается в виде отдельных клеток и коротких цепочек, оптимальная температура ее развития 40 – 45 ºС. Lactobacillus acidophillus – по морфологии близка к болгарской, но имеет другой температурный оптимум развития – 37 ºС; используется для приготовления ацидофилина [35].

Также весьма важным представителем палочковидных форм типичных молочнокислых бактерий является болгарская палочка Lactobacterium bulgaricum. Это бесспоровая, неподвижная длинная палочка, иногда соединяющаяся парами или в короткие цепочки. На твердой питательной среде дает характерные колонии, напоминающие пучки ваты [33].

 Болгарская  палочка широко распространена  в природе и является типичным  возбудителем естественного скисания  молока. Чистая культура этой бактерии применяется при приготовлении мечниковской простокваши (лактобациллина). Близкая к ней про морфологическим признакам, но развивающаяся при повышенных температурах (около 40 ºС) ацидофильная палочка (Lactobacterium acidophilum) используется при изготовлении ацидофильной простокваши (ацидофилина) [36].

К группе гомоферментативных молочнокислых бактерий относятся  также виды, обитающие на растительных субстратах (свекла, капуста, огурцы, силосная масса). Из них большой практический интерес представляет Lactobacterium delbruckii – длинная бесспоровая палочка, растущая при повышенной температуре и применяющаяся для промышленного получения молочной кислоты. Широко распространены в природе Bacterium cucumerisfermentatis – маленькая палочка, встречающаяся в огуречном и капустном рассоле, а также близкая к ней Lactobacterium plantarum. Эти бактерии находят широкое практическое применение при квашении капусты, огурцов [37].

Представителями гетероферментативных молочнокислых бактерий являются вариабельные по форме бифидобактерии из рода Bifidobacterium (B. bifidum) и кокковые из рода Leuconostoc L. mesenteroides), Lactobacillus brevis, Bacteriumcoli и другие. Некоторые гетероферментативные молочнокислые бактерии (например, Lactobacterium pentoaceticum) могут сбраживать пентозы с образованием молочной и уксусной кислот, что имеет место при силосовании кормов. Накапливающиеся при этом кислоты предохраняют силос от порчи [38].

На поверхности  прокисшего молока, капусты, кваса, силоса довольно часто развивается молочная плесень Oidium lactis, вызывающая порчу молочных и квашеных продуктов и силоса. Этот организм близко примыкает к дрожжам, но некоторыми исследователями относится к несовершенным грибам. Его вегетативное тело представлено белым многоклеточным мицелием, который распадается на отдельные клетки, так называемые оидии, то овальной, то продолговатой формы, служащие для размножения [39].

Молочнокислые бактерии имеют огромное практическое значение, так как вызываемый ими  процесс молочнокислого брожения лежит в основе переработки молочных продуктов, квашения овощей, силосования кормов. Молочнокислые бактерии либо продукты их метаболиизма активно используют в мясной, рыбной, спиртовой, кожевенной промышленности, медицине и т. д. [40, 41].

 

1.6 Характеристика сенной палочки

 

Сенная палочка (Bacillus subtilis), спороносная бактерия семейства Bacillaceae. Первоначально были описаны в 1835 Эренбергом как Vibriosubtilis, в 1872 были переименованы Коном в Bacillus subtilis [30].

 Название  «сенная палочка» вид получил из-за того, что накопительные культуры этого микроорганизма получают из сенного экстракта. Широко распространена в природе (в почве, на растительном сырье, в воздушной пыли, на поверхности пищевых продуктов и т. п.). Палочковидные вегетативные клетки (длина 2 – 3 мкм, толщина 0,4 мкм) грамположительны, размножаются делением, имеют на всей поверхности жгутики. Споры овальной формы, расположены в центре клетки. Перитрихиальное расположение жгутиков, подвижная. Колонии сухие, мелкоморщинистые, бархатистые, бесцветные или розовые. Край колонии волнистый. Растёт на МПА, МПБ, а также на средах, содержащих растительные остатки, простых синтетических питательных средах для гетеротрофов. Хемоорганогетеротроф, аммонифицирует белки, расщепляет крахмал, гликоген. Согласно Российским СанПиН, условно патогенна для человека. По данным из [29] не патогенна.

Изучено биологическое  разнообразие штаммов Bacillus subtilis на уровне генома, гены, отвечающие за синтез антибиотиков, синтез клеточной стенки, споруляции, и прорастания спор являются высоковариабельными. Для выделения культуры сенной палочки настой сена подвергают кипячению, в процессе которого другие микробы погибают, а устойчивые к высокой температуре споры сенной палочки остаются живыми и в дальнейшем прорастают [33].

 Сенная палочка – строгий аэроб; на поверхности жидких питательных сред образует тонкую беловатую плёнку, на поверхности плотных – круглые, сероватые, гладкие, блестящие колонии. Сенная палочка относится к обычным сапрофитам, разлагающим органические вещества (углеводы, белки); нередко является причиной порчи пищевых продуктов. B. subtilis является важным продуцентом протеаз, амилаз, аминокислот и некоторых полисахаридов. В частности, протеаза используется как компонент моющих средств и для удаления жира и белков при выделке шкур. Также является продуцентом полипептидных антибиотиков [37].

 В виду наличия антагонистических свойств против фитопатогенов используется в биозащите растений [40].

 

2 Объект, программа и методика исследований

 

Объектом исследования являлись слоевища листоватого лишайника Hypogymnia physodes (L.) Nyl. (рисунок 1).

 

 

 

Рисунок 1 – Слоевище лишайника Hypogymnia physodes (L.) Nyl.

 

Предметом исследования являлись экстракты слоевищ листоватого лишайника Hypogymnia physodes.

Целью исследований явилось изучение антибиотических свойств экстрактов слоевищ листоватого лишайника Hypogymnia physodes.

Программа исследований включала решение следующих задач:

1 получение экстракта лишайника;

2 проведение модельных экспериментов;

3 оформление курсовой работы.

Настоящее исследование выполнялось в рамках задания ГБЦМ 11-26 «Ресурсный и экологический потенциал сосновых лесов восточной части Белорусского Полесья в условиях глобальных изменений климата». Для изучения лишайниковой компоненты лесных фитоценозов нами было заложено 5 стационарных пробных площадок в Калининском и Приборском лесничествах (ПП 9 – 13).

Для изучения антибиотических  свойств лишайниковых метаболитов  мы выбрали вид Hypogymnia physodes как доминирующий в лихенопокрове основных лесообразующих пород Беларуси (сосна, береза, ель).

Исследования  проводили в лабораториях кафедры  ботаники и физиологии растений УО «Гомельский государственный университет им. Ф. Скорины». Слоевища лишайника измельчали с использованием шаровых мельниц. Размер частиц составил 5 – 20 мкм. Измерение диаметра частиц проводили и использованием микроскопа Nikon Eclipse 80i, оснащенного камерой Nikon DS-5M.

Для испытания  использовали свежее молоко и отвар  сенной палочки.

Отвар готовили следующим образом: конические колбы на 100 – 150 мл заранее проваривают, кипятя в них воду 15 – 20 мин. Сено из разнотравья мелко нарезают и помещают в колбу объемом 500 мл, заполняя ее на ¼ объема, добавляют щепотку мела и кипятят 15 – 20 мин, пока среда не приобретает цвет настоя крепкого чая.

Характеристика  культуры сенной палочки (Bacillus subtilis). Наблюдают на поверхности жидкости бактериальную пленку. Это культура сенной палочки (Bacillus subtilis), которая при старении, на 3 – 4-е сутки, становится серовато-зеленоватой. Другие микроорганизмы при этом вырастают редко и в небольших количествах.

 

 

 

 

Всего было заложено 9 вариантов опыта с каждой из исследуемых сред:

1. ацетоновый экстракт, полученный в аппарате Сокслета;
2. ацетоновый экстракт, полученный на аппарате для встряхивания;
3. карбонатный экстракт, полученный на аппарате для встряхивания;
4. водный экстракт, полученный при охлаждении раствора на аппарате для встряхивания;
5. водный экстракт, полученный с использованием заморозки раствора на аппарате для встряхивания;
6. толуоловый экстракт, полученный на аппарате для встряхивания;
7. измельченные слоевища лишайника;
8. измельченные слоевища лишайника после экстрагирования вторичных метаболитов в аппарате Сокслета;
9. контрольный раствор без добавления экстракта.

 

 

3 Результаты исследований и их обсуждение

 

Лес является одной  из основ хозяйственной деятельности человека, источником получения материальных ресурсов (древесины, пищевых, лекарственных  и технических, продукции охотничьего  промысла), базой для развития лесного  хозяйства, деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности, отдыха и туризма, других отраслей экономики.

По [42] распределение площади покрытых лесом земель в разрезе основных лесообразующих пород Республики Беларусь на 01.01.2006 составило:

 

Таблица 1 – Распределение площади покрытых лесом земель в разрезе основных лесообразующих пород Республики Беларусь [42]

Основные лесообразующие породы	Площадь покрытых лесом земель
	тыс. га	проценты
Сосна	3474,6	50,4
Береза	1540,1	22,4
Ель	676,0	9,8
Ольха черная	578,6	8,4
Дуб	240,9	3,5
Осина	147,4	2,1
Прочие	230,7	3,4
Итого	6888,3	100

 

Таким образом, на долю сосновых, березовых и еловых лесов приходится более 80 % лесного  фонда Беларуси.

Известны субстратные  предпочтения наиболее распространенных видов эпифитных лишайников. На стволе и ветвях сосен и елей во всех климатических зонах доминирует Hypogymnia physodes. В северных бореальных лесах высокая частота встречаемости также характерна для некоторых других листоватых и кустистых видов, например, для Parmelio psisambigua и Platismatia glauca [43 – 45]. Однако, в Беларуси эти виды не достигают значимого распространения и развития. Среди листоватых лишайников, доминирующих в эпифитных синузиях березы, можно выделить только один вид – Hypogymnia physodes [46,47].

Таким образом, в Беларуси на деревьях, составляющих более 80 % лесных насаждений, доминирует один вид листоватых лишайников – Hypogymnia physodes (L.) Nyl.

Согласно [48] в талломах Hypogymnia physodes содержатся:

• атранорин,
• физодовая кислота,
• физодаловая кислота,
• 3-гидроксифизодовая кислота,
• 2’-О-метилфизодовая кислота,
• хлоратранорин,
• протоцетраровая кислота.