Методы световой микроскопии

Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

ОКРАСКА ВИРУСОВ.

В. ВНУТРИЯДЕРНОГО ВКЛ.,ПРИРОДА,ИХ ДИАГНОСТИКА.

Вирусные тельца-включения – образования, состоящие или из скоплений вирусных частиц (вирионов), или из клеточного материала. Они встречаются при многих вирусных инфекциях и представляют собой овальные оксифильные тельца

Ядерные включения встречаются при инфекциях, вызываемых крупными вирусами (герпес, болезнь Ауески, ИРТ, ринопневмония лошадей и др.) так и вирусами, имеющими очень мелкие размеры (ящур, гепатит собакРазличаютдва типа внутриядерных включений: А и В. Включения типа А – аморфные или округлой формы оксифильные образования, четко отграниченные от базофильной массы ядра; нуклеоплазма находится в состоянии глубокой деструкции; хроматин расположен глыбками на деформированной оболочке ядра. Включения типа А встречаются при ринопневмонии лошадей, ИРТ КРС, ларинготрахеите птиц, болезни Ауески. Включения типа В имеют вид ацидофилных гиалиновых зерен, нуклеоплазма относительно мало изменена. Они преимущественно при болезни Тешена, Аденоинфекции.

При ряде вирусных болезней обнаружение телец – включений имеет диагностическое значение. Многие из них настолько патогномоничны, что обнаружение их, стало основным из экспресс методов диагностики бешенства, оспы, ринопневмонии лошадей, аденовирусной инфекции и ИРТ КРС. В диагностике гриппа животных, болезни Ауески, ларинготрахеита птиц и других болезней выявление телец включений – вспомогательный метод. На частоту выявления телец – включений, кроме штаммовых различий влияет и возраст животного (у молодых они появляются с большим постоянством) и физиологическое состояние организма.

Электронная микроскопия вирусов, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (105 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП -прибор для наблюдения и фотографирования многократно (до 106 раз) увеличенного изображения объекта, в к-ром вместо световых лучей используются пучки электронов, ускоренных до больших энергий (30-1000 кэВ и более) в условиях глубокого вакуума.

Вирусы имеют величину 10-100 нм и не видны в световой микроскоп(разрешение светового микроскопа 200 нм

1.Работать в лаборатории необходимо в халате, защищая одежду и кожу от попадания и разъедания реактивами и обсемененности микроорганизмами.

Каждый должен работать на закрепленном за ним рабочем месте. Переход на другое место без разрешения преподавателя не допускается.

Рабочее место следует поддерживать в чистоте, не загромождать его посудой и побочными вещами.

Студентам запрещается работать в лаборатории без присутствия преподавателя или лаборанта, а также в неустановленное время без разрешения преподавателя.

До выполнения каждой лабораторной работы можно приступить только после получения инструктажа по технике безопасности и разрешения преподавателя.

Приступая к работе, необходимо: осознать методику работы, правила ее безопасного выполнения; проверить соответствие взятых веществ тем веществам, которые указаны в методике работы.

Опыт необходимо проводить в точном соответствии с его описанием в методических указаниях, особенно придерживаться очередности добавления реактивов.

Для выполнения опыта пользоваться только чистой, сухой лабораторной посудой; для отмеривания каждого реактива нужно иметь мерную посуду (пипетки, бюретки, мензурку, мерный цилиндр или мерный стакан); не следует выливать избыток налитого в пробирку реактива обратно в емкость, чтобы не испортить реактив.

Если в ходе опыта требуется нагревание реакционной смеси, надо следовать предусмотренным методическим указаниям способа нагрева: на водяной бане, на электроплитке или на газовой горелке и др. Сильно летучие горючие вещества опасно нагревать на открытом огне.

Пролитые на пол и стол химические вещества обезвреживают и убирают под руководством лаборанта (преподавателя) в соответствии с правилами.

При работе в лаборатории следует соблюдать следующие требования: выполнять работу нужно аккуратно, добросовестно, внимательно, экономно, быть наблюдательным, рационально и правильно использовать время, отведенное для работы.

По окончании работы следует привести в порядок свое рабочее место: помыть посуду, протереть поверхность рабочего лабораторного стола, закрыть водопроводные краны, выключить электрические приборы.

2) Транспортировка и хранение проб. Взятые пробы необходимо как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедление процессов инактивации вируса. Такие условия обеспечивают низкие температуры. Для этого пробирки (флакончики) с патматериалом, закрытые резиновыми пробками, помещают в термос с охлаждающей смесью.  
 
Первичная емкость: емкость, содержащая пробу (пробирка с завинчивающейся пробкой с нетоксичной резиновой прокладкой, обернутой лейкопластырем, или запаянная стеклянная ампула); 
 
^ Внутренняя упаковка: - поглощающий материал — папиросная бумага или вата в количестве, достаточном для впитывания жидкости в случае утечки; 
 
- пластиковый мешок, заполненный или заклеенный неволокнистым лейкопластырем; 
 
^ Наружная упаковка: -противоударная прокладка, (скомканная бумага или вата);- твердый водонепроницаемый контейнер;- плотно пригнанная крышка, завинчиваемая или уплотняемая, заклеиваемая лейкопластырем или закрепляемая зажимами. 
 
Патматериал снабжают надежной и четкой этикеткой недопустимо делать надписи карандашом по стеклу. На пробирке или флакончике достаточно надежной является этикетка из лейкопластыря, которую подписывают простым карандашом. На термос с пробами патматериала навешивают бирку из картона, на которою указывают хозяйство, вид животного, вид материала и дату. Термос опечатывают. Взятый материал с сопроводительным документом, содержащим полную информацию о животном, от которого взяты пробы, об эпизоотологических данных хозяйства, предположительном диагнозе мерах, принятых для ликвидации болезни (лечение, вакцинации и т.д.), а также дату и фамилию ветеринарного врача, направляют с нарочным. Этими данными руководствуются при выборе направления лабораторных исследований. Доставленные в лаборатории пробы рекомендуется немедленно использовать для выделения вируса. Если по каким-то причинам (отсутствие экспериментальных животных, куриных эмбрионов, культур клеток) исследование откладывается, материал хранят при температуре минус (40... 70)

3) Накожный метод. На кожу спины или живота, освобождённую от шерсти, наносят царапины скарификационной иглой. Материал берут стеклянной палочкой и втирают досуха. 
 
Внутрикожный метод. Местом введения обычно выбирают кожу спины или живота. Шерсть на этом месте за два дня до опыта удаляют депилятором. Используют очень тонкие и острые иглы с пологим скосом. Иглу вводят в кожу под очень острым углом скосом вверх.. 
 
Подкожный метод. Иглу шприца вводят в основание кожной складки предполагаемого места инъекции. После прокола кожи направление иглы меняют и медленно вводят жидкость .место введения обрабатывают антисептиком. Следят за тем, чтобы введенный материал не вытекал наружу. 
 
Внутримышечный метод. Лучшим местом введения считается участок с развитым мышечным слоем в области верхней трети задней лапы животного. Острие иглы направляют почти перпендикулярно участку.  
 
Внутривенный метод. Инъекцию производят в краевую вену уха кроликов, яремную вену морских свинок, хвостовую вену крыс или мышей. Обрабатывают кожу над веной. Для лучшего наполнения вены ее пережимают ниже будущего введения или кожу обогревают теплой (550С) водой. Материал вводят медленно.  
 
Интраназальный метод. Животное фиксируют, с помощью эфира или хлороформа вызывают состояние лёгкого наркоза. Материал вводят в нос животному маленькими каплями шприцем и иглой с насаженным тонким зондом. Материал можно капать непосредственно на нос животного, контролируя его попадание в носовые ходы.  
 
Внутрибрюшинный метод. Инъекцию производят в задней трети живота. Место введения обрабатывают антисептиком до и после инъекции. Животное располагают вниз головой или в наклонном положении. Несколько отступив от средней линии, брюшную стенку прокалывают, вводят иглу под тупым углом к стенке. Игла должна быть с притупленным концом во избежание повреждения внутренних органов.

4) Выделение вируса из исследованного материала - самый важный этап в диагностике вирусных болезней. Его проводят на живых чувствительных к предполагаемому вирусу системах: на животных: куриных эмбрионах и культурах клеток. 
 
Для заражения чувствительных систем из материала (кусочки органов и тканей) готовят суспензию. С этой целью материал измельчают, растирают в ступке со стерильным кварцевым песком, разводят стерильным физиологическим раствором, освобождают от крупных частиц путем центрифугирования в течении 20-30 мин.. За тем суспензию освобождают от бактерий и грибов, используя для этой цели Контролируют эффективность такой обработки посевом на питательные среды для аэробов, анаэробов и грибов. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения живых объектов. 

1)Призн. Размнож. В. В организм лаб  животного  
Признаками размножения вируса или патогенных бактерий в организме лабораторных животных являются характерные для данной болезни симптомы или их гибель. О размножении микроорганизмов в организме свидетельствуют и характерные для данного заболевания патологоанатомические изменения в органах и тканях животных. При выделении из органов павших лабораторных животных вирусов или бактерий их идентифицируют с помощью серологических реакций со специфическими сыворотками. Если зараженное животное не погибло, его уничтожают в момент максимального проявления симптомов болезни или при их отсутствии на 8-10 сутки после заражения. От павших или убитых животных берут пораженные органы и ткани и выделяют из них соответствующего возбудителя болезни вирусологическими или бактериологическими методами. Только после этого ставят окончательный диагноз. 
 
2) бнаружить тельца-включения под световым или люминесцентным микроскопом.

Тельца-включения — это внутриклеточные включения, образующиеся в клетках при репродукции в них некоторых вирусов. По природе они представляют собой либо скопления (колонии) вирионов, либо измененный под действием вируса клеточный материал, либо комбинацию первого со вторым. Тельца-включения могут находиться в цитоплазме (чаще это РНК-содержащие вирусы) или в ядре (чаще это ДНК-содержащие вирусы, кроме вируса оспы), или в цитоплазме и ядре клетки (вирус чумы собак). Тельца-включения, образуемые некоторыми вирусами, получили специальное название, так, тельца-включения при оспе кур называются тельцами Боллингера, при чуме плотоядных — Ленца, при бешенстве — Бабеша—Негри и др. При обнаружении телец Бабеша—Негри в мазках головного мозга погибшего животного наличие бешенства считается доказанным. При других вирусных инфекциях обнаружение телец-включений имеет лишь вспомогательное диагностическое значение; 
 
3) Применяют следующие методы консервации вирусов:

при хранении вирусного материала (кусочки органов или тканей) часто используют глицерин (50%-ный раствор на ИХН), который обладает бактериостатическим действием и в то же время защищает вирусы. При этом можно хранить несколько месяцев при 4С.

чаще всего хранят вирусы в холодильниках, обеспечивающих температуру -20, -30, -70С. При этой температуре некоторые вирусы без добавки защитных веществ сравнительно быстро теряют инфекционность. Хорошее защитное действие при замораживании и хранении вирусов оказывает добавка: инактивированной сыворотки крови или обезжиренного молока или 0,5-1,5% желатина.

Быстрая заморозка до минус 196С жидким азотом. Вирусы, чувствительные к низким значениям рН, следует замораживать в жидкостях, не содержащих однозамещенных фосфатов.