Ботулизм

Федеральное Государственное  Бюджетное Образовательное Учреждение                          Высшего Профессионального Образования 

«Московская Государственная  Академия Ветеринарной Медицины и Биотехнологий 

им. К.И. Скрябина».

 

Кафедра микробиологии  и микологии.

 

 

 

 

 

Реферат.

 

Дисциплина: Частная микробиология.

Тема: «Возбудитель Ботулизма»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выполнила: студентка 2 курса  ФВМ 6 группы,

Седова А.П.

Проверила: преподаватель  кафедры,

Родионова В.Б.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Москва, 2013.

Содержание:

• Ботулизм, возбудитель ботулизма.
• Бактериологическое исследование:

- материал для исследования;

- обнаружение возбудителя в  исследуемом материале;

- обнаружение и идентификация токсина – биопроба;

• Выделение и идентификация культуры возбудителя:

- культуральные свойства;

- ферментативные свойства.

• Токсинообразование.
• Антигенная структура.
• Устойчивость.
• Патогенность, патогенез.
• Иммунитет, средства специфической профилактики и биопрепараты.
• Заключение
• Список используемой литературы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ботулизм -

Остропротекающая кормовая токсикоинфекция, возникающая вследствие поедания кормов, содержащих токсин возбудителя. Заболевание развивается вследствие воздействия ботулинического токсина на организм, проявляется поражением центральной нервной системы и  параличом мышц глотки, языка, нижней челюсти и скелетных мышц.

Возбудитель – Clostridium botulinum. Был открыт в 1896 г. Ван Эрменгемом, выделившим его из зараженной ветчины и печени человека, умершего от ботулизма. Дальнейшее изучение показало, что в природе существуют семь сероваров 

C. botulinum: A, B, C, D, E, F и G, которые различаются по антигенной структуре экзотоксина. К ботулизму восприимчивы многие виды животных, в том числе птицы, а так же люди. Из лабораторных животных – белые мыши и морские свинки.

В соответствии с рекомендациями ВОЗ различают четыре категории ботулизма:

1) пищевой ботулизм (заболевание возникает после употребления в пищу продуктов, содержащих накопившийся ботулинический токсин); 

2) раневой ботулизм (развивается при загрязнении почвой раны, в которой создаются условия, необходимые для прорастания попавших из почвы Clostridium botulinum и последующего токсинообразования);

3) ботулизм детского возраста (возникает у детей преимущественно до 6 месяцев, при инфицировании их спорами Clostridium botulinum);

4) ботулизм неуточнённой природы (установить какую-либо связь возникшего заболевания с пищевым продуктом не удаётся).

По степени тяжести  различают лёгкую, среднетяжёлую  и тяжёлую форму болезни. При лёгком течении у больных паралитический синдром ограничивается поражением глазодвигательных мышц; при среднетяжѐлом поражаются и мышцы глотки, гортани. Тяжёлое течение характеризуется дыхательной недостаточностью и тяжёлыми бульбарными нарушениями.

Бактериологическое исследование.

 

Материал для  исследования.

В лабораторию направляют пробы корма, вызвавшего отравление; от павших животных – содержимое желудка, кишечника, кусочки печени, селезенки; от больных животных – кровь. Материал берут в течение двух часов после гибели животного.

Нативный материал исследуют  одновременно на наличие возбудителя и токсинов. Кровь исследуют только на токсин и быстро, на месте, так как токсин в крови быстро разрушается.

 

Обнаружение возбудителя в исследуемом материале.                                          Морфологические и тинкториальные свойства. В препаратах, окрашенных по Граму, C. Botulinum имеет вид прямой или слегка изогнутой, с закругленными концами грамположительной палочки размером (0,6 – 1,4) * (4 – 9). Бактерии располагаются изолированно или парами, иногда в виде коротких цепочек. Микроб подвижен и имеет жгутики, большинство клеток из старых культур без жгутиков. Образует споры, располагающиеся субтерминально, редко центрально ( имеет вид теннисной ракетки). Капсул не образует.

Вегетативные клетки хорошо окрашиваются спирто-водными растворами анилиновых красок, грамположительные в молодых культурах и на препаратах из тканей, в старых культурах – грамотрицательные.

 

Обнаружение и идентификация  токсина – Биопроба.

Метод применяют для  обнаружения токсина в исследуемом  материале, а так же для подтверждения  токсигенных свойств выделяемой культуры возбудителя, относящегося к  одному из семи сероваров. Все семь сероваров экзотоксина иммунологически  специфичны, что выявляют в реакции нейтрализации.

Для обнаружения токсина исследуемый  материал (20-30 гр.) растирают в физиологическом растворе (в соотношение 1: 2), экстрагируют при комнатной температуре 2 ч., фильтруют через вату и делят на две части. Одну часть прогревают при 100 С 20-30 мин. Затем нативный и прогретый фильтрат вводят внутривенно или внутрибрюшинно двум белым мышам. Морских свинок заражают подкожно в дозе 3-5 мл. При наличии ботулинического токсина животные, которым был введен кипяченый фильтрат, остаются живыми, нативный – погибают на 2-5 сутки с характерной клиникой ботулизма: шаткая походка, учащенное дыхание, расслабление скелетной мускулатуры, западание брюшной стенки («осиная талия»).

При обнаружение токсина в исследуемом  материале проводят его идентификацию. Для этого смешивают по 0,2 мл. различных антисывороток в одной пробирке ( A, B, C, D, и др.), добавляют 1 мл. экстракта, выдерживают 45 мин. При 35-37 С и вводят внутрибрюшинно двум белым мышам. Контрольным животным вводят смесь фильтрата с физиологическим раствором. При выживании мышей, зараженных смесью фильтрата и сыворотки, и при гибели контрольных токсин идентифицируют как ботулинический. Этот результат служит достаточным основанием для постановки положительного диагноза на ботулизм. При необходимости определяют тип токсина в РН: смешивают 2,4 мл. фильтрата и 0,6 мл. типовых сывороток, выдерживают в термостате и ставят биопробу на мышах, как было описано выше.

 

Выделение и идентификация  культуры возбудителя.

Основное направление при лабораторной диагностике ботулизма – обнаружение ботулинического токсина. Выделение чистой культуры с испытанием ее токсигенных свойств проводят только при отрицательных результатах исследований на наличие токсина в материале.

Культуральные свойства.

С. botulinum – строгий анаэроб. На поверхности плотных питательных сред растет при условии, если остаточное давление воздуха не превышает 3-6 мм. рт. ст. Для культивирования используют специальные среды: глюкозо- кровяной агар Цейсслера, печеночный агар с глюкозой, агар столбиком с глюкозой, среду

Китта – Тароцци, бульон Хоттингера под вазелиновым маслом с кусочками мяса или печени и добавлением непосредственно перед посевом 0,5-1% глюкозы. Температурный оптимум для роста и токсинообразования бактерий сероваров A, B, C, D – 35 C, для сероваров E и F 28 – 30 C. Споры сероваров  E и F могут прорастать, размножаться и образовывать токсин даже при 4 С, развитие и токсинообразование сероваров А и В возможно при температуре 10 – 55 С. Оптимум  рН 7,2 – 7,7. 

Чтобы выявить культуру возбудителя, исследуемый материал высеивают в два флакона со средой Китта – Тароцци, один прогревают при  80 С 1ч., затем оба флакона инкубируют. Рост возбудителя характеризуется постепенным помутнением среды (на 2-3-и сутки), газообразованием, затем появляется осадок и жидкость светлеет, культура издает запах прогорклого масла. На 5-7 – е сутки инкубирования испытывают токсигенные свойства культуры (биопробу). Для выделения чистой культуры первичные посевы прогревают при 80С 1ч. и дробно рассеивают на глюкозо – кровяной агар в чашках Петри. Посевы инкубируют в анаэростате. Через 4-5 сут. просматривают посевы. Колонии  C. botulinum круглые, с корневидными отростками, бесцветные или сероватые с зоной бета – гемолиза.

На агаре Цейсслера вырастают прозрачные колонии  - росинки величиной в несколько миллиметров с ровными или изрезанными краями и блестящей поверхностью, окруженной зоной гемолиза. Окрашены колонии в слегка коричневатый или серовато – мутный цвет, их середина выпуклая или вогнутая.  Крупные колонии более плоские. В пределах одного штамма встречаются колонии нескольких типов. Одни штаммы дают полный гемолиз, другие только обесцвечивают агар. В агаре столбиком колонии имеют форму чечевиц или комочков ваты с уплотненным центром. 

Ферментативные свойства.

При посеве на среды с  сахарами C. botulinum ферментирует с образованием газа и кислоты: глюкозу, левулезу, мальтозу, глицерин, декстрин, салицин, адонит, инозит и не разлагает галактозу, сахарозу, дульцит, манит, арабинозу и рамнозу. Однако эти свойства непостоянны и не могут служить критерием идентификации микроба и  дифференциации его сероваров.

Бактерии сероваров  А и В обладают высокой протеолитической активностью: они полностью переваривают кусочки печени и мышц в жидких средах; протеолитические свойства серовара F выражены слабее и минимальны у сероваров C, D и E.

Токсинообразование.

В анаэробных условиях в  организме животных, субстратах растительного  и животного происхождения , а  так же на специальных питательных  средах C. botulinum синтезирует чрезвычайно активный экзотоксин, относящийся к группе нейротоксинов. Самый сильный токсин вырабатывает серовар А.

Каждый из семи сероваров  возбудителя ботулизма обладает токсином, имеющим только ему присущую антигенную структуру. В составе токсина различают не менее пяти факторов: нейротоксин, гемолизин, гемолизи – гемагглютинин, липазу и протеазу. Токсическими факторами C. botulinum так же являются ферменты патогенности и среди них протеиназы, лецитиназы и декарбоксилазы. 

 

Антигенная структура.

Все семь сероваров экзотоксина обладают иммунологической специфичностью, выделяемой в реакции  нейтрализации. Специфичность токсинов сероваров А, В и Е очень высока, С и D – несколько ниже. Токсины этих двух сероваров не нейтрализуются антитоксинами А, В и Е, но не большие дозы токсинов С и D перекрестно нейтрализуются большими количествами антитоксинов D  и C. Известен так же факт перекрестной нейтрализации специфическими антисыворотками ботулинических токсинов сероваров Е и F.

Возбудители ботулизма имеют жгутиковый Н- и соматический О – антигены, четко развивающиеся в реакции агглютинации. О – антиген является групповым, общим для протеолитических штаммов C. botulinum  сероваров А, В и С.sporogenes. Н- антиген типоспецифичен. Наблюдается совпадение его у бактерий, различающихся по варианту экзотоксинов. 

Устойчивость.

Вегетативной клетки возбудителя малоустойчивы к различным факторам внешней среды. Температура 80С убивает их через 30 мин, кипячение через 2-5 мин. Резистентность спор высока. В высушенном состоянии они могут сохранять жизнеспособность десятилетиями. К нагреванию споры более устойчивы в среде, содержащей значительное кол-во жира. Наличие в среде ионов железа, кальция, высокая концентрация сахарозы, также повышает устойчивость к нагреванию.

Споры клостридий, ботулизма, сераваров А, В, F, наиболее устойчивы к кипячению; наименее резистентны споры серовара Е. Споры сероваров С и D имеют промежуточною степень терморезистентности. Так, споры сероваров A иB хорошо переносят кипячение при температуре 100С в течении 5ч и погибают только через 6 часов. При нагревании до 105С споры погибаю не ранее чем через 2 часа, при 120 через 20-30 минут. Поэтому надёжным способ обезвреживанием спор возбудителем ботулизма является автоклавирование не менее 30 минут при 120С .Молодые споры из 6-10ти дневных культур сероваров А и В более устойчивы к температуре, чем споры старых культур.  

Споры хорошо переносят  низкие температуры и не погибают при -190С. При -16С сохраняются до года, но часть их при этом разрушается. Споры сереваров А и В также обладают высокой радиорезистентностью. Они могут переносить облучение 2-3 Мрад, но эта способность у различных штаммов не одинакова и зависит от состава среды, её PH и концентрации спор. Желудочный сок и пищеварительные ферменты их не разрушают.

 Устойчивы споры  и к различным бактерицидным  веществам. В 5% феноле они сохраняются одни сутки, в 10% раствор соляной кислоты убивает их при комнатной температуре через один час, 40% формалин в двойном разведении – через 24 часа, в этиловом спирте они могут сохранять жизнеспособность 2 месяца. Такой же срок они выдерживают в среде, содержащей 14% поваренной соли.

Ботулинический токсин в жидких средах разрушается при  кипячении через 15-20 минут, в твёрдых  субстратах – через 2 часа. Протеолитические ферменты желудочно-кишечного тракта не разрушают токсины сероваров A, B, C, D, F, но усиливают активность токсина серовара Е. В кислой среде РН 3,5-6,8 устойчивость токсинов больше, чем в щелочной, при РН 7,8 они значительно снижают свои токсические свойства, РН выше 8,5 их инактивирует. В зерне токсин может сохраняться месяцами; солнечный свет и высушивание его ослабляют, но полностью не обезвреживают зерно в течении 93 дней. Зерно, обработанное 1% раствором гидроокиси натрия, теряет токсические свойства через 3-6 часов.

 

Патогенность. Патогенез.

Наиболее чувствительны к ботулиническому токсину лошади, у них болезнь чаще вызывается токсинами серовара В, реже сероваров А и С. Крупный рогатый скот поражается токсинами сероваров С и D. Овцы и козы, также чувствительны к токсинам C и D. У коз ботулизм встречается чрезвычайно редко, но они очень чувствительны к токсину C. Свиньи в естественных условиях проявляют к ботулизму особую устойчивость, однако экспериментально заболевание можно вызвать всеми сероварами токсина, причём животные более чувствительны к сероварам В и F, известны случаи заболевания свиней, обусловленные токсином А. Собаки, волки, кошки, койоты, другие хищники, серые крысы – резистентны к заболеванию, исключение составляют норки, которые проявляют высокую чувствительность у ботулизму и поражаются чаще всего токсином серовара С. Описан ботулизм песцов, черно-бурых лисиц и ондатр.

К ботулизму восприимчивы птицы, известно более 36 видов птиц, у которых зарегистрирована эта болезнь, и среди них куры, индейки, утки, гуси, чайки и голуби. Ботулизм у птиц вызывается преимущественно токсинами сероварами С и А и В. Рыбы, амфибии и рептилии к ботулизму практически невосприимчивы. Восприимчив к ботулизму человек, в качестве этиологических факторов заболевания у человека обнаружены: клостридии сероваров А, В, Е.