Кинетика ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой

Влияние концентрации фермента

 

При данных условиях две молекулы фермента, действующие  в растворе независимо друг от друга, за определенный промежуток времени  вызовут превращение в два  раза большего количества субстрата, чем  одна молекула; поэтому скорость реакции  будет пропорциональна концентрации фермента

υ=k[E]        (17)

В подавляющем  большинстве случаев действительно  имеет место подобное соотношение, и именно на нем основываются почти  все методы определения концентрации ферментов. Типичные примеры приведены  на рис. 1, однако от них могут наблюдаться отклонения, и прежде чем проводить дальнейшие кинетические исследования или пытаться рассчитать удельные активности, необходимо показать, что между скоростью и концентрацией фермента (в исследуемом диапазоне) имеется линейная зависимость.

Рис. I.4.1. Типичные примеры влияния концентрации фермерта на скорость реакции. I – аспартат аммиаклиаза; II – фумаратгидратаза; III – акоиитатгидратаза.

Отклонения  от линейности нередко обусловлены  несовершенством системы определения активности; встречаются, однако, случаи, когда такие отклонения являются следствием свойств самого фермента.

 

Влияние концентрации субстрата

 

В подавляющем  большинстве случаев в ферментативных реакциях участвует не один а большее число субстратов. Это справедливо даже для гидролазных реакций, которые часто рассматривают как односубстратные, поскольку второй субстрат (вода) присутствует в очень высоких концентрациях, и можно считать, что фермент постоянно насыщен водой. Хотя односубстратные реакции встречаются в биохимических системах относительно редко, они, однако, являются весьма полезной простой моделью для построения и обсуждения теорий ферментативной кинетики; при этом большинство получаемых выводов могут быть непосредственно использованы при рассмотрении более сложных ферментативных реакций.

 

Влияние рН

 

Ферменты, вообще говоря, активны только в определенном интервале рН, и в большинстве  случаев для действия каждого  фермента имеется определенный оптимум  рН. Наличие такого оптимума может  иметь несколько причин: 1) истинное обратимое влияние рН на скорость реакции V (в условиях, когда фермент насыщен субстратом); 2) влияние рН на сродство фермента к субстрату (в этом случае падение активности по обе стороны от оптимума рН будет следствием понижения насыщения фермента субстратом в силу понижения сродства); 3) влияние рН на стабильность фермента, который может необратимо инактивироваться при рН по одну или по обе стороны от оптимума. Перечисленные факторы могут действовать и в комбинации друг с другом; например, падение активности по одну сторону от оптимума рН может быть результатом уменьшения сродства фермента к субстрату, а по другую — результатом инактивации фермента.

Действие рассматриваемых  факторов можно легко различить  экспериментальным путем. Наличие необратимой инактивации устанавливают, сначала инкубируя фермент в растворах с различными значениями рН а затем определяя его активность по возвращении рН к определенному значению. На рис. 4 приведены результаты опытов такого рода для моноаминоксидазы, из которых видно, что падение активности в щелочной области (по отношению к оптимуму рН) вызвано инактивацией фермента. Так как степень инактивации фермента со временем увеличивается, то и форма кривой, и положение кажущегося оптимума рН зависят от времени, в течение которого проводятся наблюдения; если бы можно было определить истинные начальные скорости сразу же после приведения раствора фермента к определенному значению рН, то тогда фактор инактивации был бы полностью исключен.

Рис. I.4.4. Влияние рН на активность моноаминоксидазы. I – активность при рН, указанных на оси абсцисс, II – активность при рН=7,3 после инкубации в течение 5 мин при рН, указанных на оси абсцисс.

Влияние рН на активность ферментов осуществляется путем  изменения в состоянии ионизации отдельных компонентов системы при изменении рН. Такие изменения могут происходить в свободном ферменте, в фермент-субстратном комплексе или субстрате. Поскольку ферменты представляют собой белки, молекулы которых содержат большое число ионизирующихся групп, то они могут находиться в виде целого ряда различных ионных форм, причем распределение всего количества фермента между этими ионными формами зависит от рН и от констант ионизации различных групп. Поскольку, однако, каталитическая активность наблюдается обычно в относительно небольшом интервале значений; рН, можно думать, что только одна из ионных форм фермента (или, точнее, его активного центра) каталитически активна, как это и предполагали Михаэлис и Дэвидсон. Имеется ряд соображений в пользу того, что ионизация тех групп в ферменте, которые удалены от активного центра, либо оказывает незначительное влияние, либо совсем не оказывает влияния на каталитическую активность; в то же время состояние ионизации групп, расположенных в самом активном центре или около него, очень существенно.

Если фермент  активен только в одном состоянии  ионизации, то из этого (в первом приближении) следует, что активность его будет  в значительной мере определяться ионизацией двух особых групп в активном центре или вблизи него, а именно тех групп, которые в первую очередь ионизируются (или, наоборот, деионизируются) при сдвиге рН в кислую или щелочную сторону от оптимума. Эти группы иногда называют кислой и основной группами фермента.

 

Влияние температуры

 

Влияние температуры  на скорость ферментативных реакций может быть обусловлено действием ряда различных факторов. Температура влияет на стабильность фермента; на скорость распада фермент-субстратного комплекса (т.е. на k₊₂), определяемую по величине теплоты активации реакции; на сродство фермента к субстрату (т.е. на k₊₁ и k_-1); на величину рН функций одного или всех компонентов; на сродство фермента к активаторам или ингибиторам; на природу ключевой и даже на такие факторы, как рН используемого буферного раствора.

Многообразие форм, в которых проявляется влияние температуры на скорость ферментативных реакций, дает основание ожидать, что анализ этого влияния должен представлять большие трудности. В действительности, однако, влияние температуры легко исследовать экспериментально. Влияние на стабильность фермента можно изучить, инкубируя фермент при различных значениях температуры в течение определенного периода времени, а затем определяя его активность в той температурной зоне, в которой он остается стабильным. Влияние температуры на сродство фермента к субстрату или активатору можно элиминировать использованием достаточно высоких концентраций субстрата или активатора, при которых фермент оказывается насыщенным, что дает возможность определить влияние температуры на V. Влияние на константу Михаэлиса можно изучить с помощью обычных методов, в некоторых случаях можно даже определить влияние температуры на каждую из трех констант скорости. Влияние на рК каждого из компонентов реакции определяется с помощью методов, описанных в последнем разделе этой главы. В полиферментных системах каждый фермент обычно можно изучать в отдельности, чтобы таким образом избежать лимитирующих влияний на скорость наблюдаемого процесса со стороны других ферментов. Наконец, влияние температуры на большую часть прочих факторов можно, как правило, исключить, если достаточно тщательно следить за всеми деталями методики проведения опытов.

 

 

 

Теплота инактивации ферментов

 

Если построить  серию кривых, отражающих ход ферментативной реакции при различных значениях  температуры, то эти кривые будут в общем случае близки к тем, которые изображены на рис. 5. Хотя истинная начальная скорость реакции неуклонно увеличивается по мере повышения температуры, количество субстрата, подвергшегося превращению за определенный промежуток времени, вначале повышается, а затем падает, вследствие чего наблюдается кажущийся температурный оптимум. Эта наблюдаемая оптимальная температура не остается постоянной, она падает по мере увеличения промежутка времени, в течение которого рассматривается процесс что видно, например, из сравнения t₁ и t₂ на рис. I.4.5.

Рис. I.4.5. Типичные кривые хода ферментативной реакции при различных значениях температуры, показывающие зависимость кажущегося температурного оптимума от времени наблюдения.

В данном случае одновременно действуют два различных  фактора, определяющих влияние температуры: с одной стороны — увеличение начальной скорости (или истинной каталитической активности фермента), с другой — деструкция фермента при более высоких значениях температуры, обусловливающая непрерывное уменьшение концентрации активного фермента. Все это проявляется в увеличении кривизны приведенных на рис. 5 кривых при повышении температуры. Оптимальная температура зависит от соотношения между влиянием температуры на скорость ферментативной реакции и ее влиянием на скорость деструкции фермента, так что наблюдаемые величины температурных оптимумов, в сущности, не имеют особого значения.

Скорость инактивации  ферментов в растворе быстро возрастает с повышением температуры; почти  во всех случаях инактивация происходит практически мгновенно при значениях температуры, близких к 100 °С, в большинстве же случаев она наступает при температуре около 70 °С. Число ферментов, которые устойчивы при температуре 100 °С, исключительно мало; классическим примером может служить аденилаткиназа, выдерживающая в течение продолжительного времени температуру 100 °С при рН 1. Интересно, однако, что некоторые бактерии, обычно живущие в условиях высоких температур (так называемые термофильные бактерии), содержат ферменты, отличающиеся необычно высокой термостабильностью.

Тепловая инактивация  ферментов почти всегда является результатом денатурации белка. Температурный коэффициент процесса инактивации значительно выше, чем  у какого-либо другого известного процесса, за исключением денатурации  белков величина этого коэффициента может, однако, сильно варьировать — от 10 до нескольких сотен.

Измерение ферментативной активности вооружает специалиста  в области химии белка быстрым  методом, с помощью которого он может  вести наблюдение за ходом денатурации.

Скорость инактивации  ферментов (как и вообще денатурации белков) в большинстве случаев сильно зависит от рН раствора. Влияние рН на инактивацию различных ферментов может быть весьма различным. Обычно имеется область максимальной стабильности фермента, причем она не обязательно располагается поблизости от его изоэлектрической точки; инактивация увеличивается при сдвиге в кислую и щелочную сторону от этой области. Многие ферменты уже при рН 4-5 и 8-10 инактивируются даже при комнатной температуре. Так как параметры инактивации значительно изменяются с изменением рН, то следует проявлять осторожность при выведении каких-либо заключений общего характера из наблюдений, относящихся только к одному значению рН. Другие факторы, помимо рН, например ионная сила, концентрация белка и защитное действие субстратов, ингибиторов и прочих веществ, также могут оказывать значительное влияние на скорость инактивации. Имеет значение также и содержание воды, ибо в высушенном состоянии ферменты весьма термостабильны.

В ряде случаев  тепловая денатурация оказывается обратимой. В некоторых случаях обратимой тепловой денатурации оказывается возможным определить равновесие между активной и неактивной формами фермента. Правда, проделать это без нарушения равновесия обычно весьма трудно.

Хотя стабильность ферментов, как правило, наиболее высока при низких температурах (поэтому выделение ферментов обычно проводят в холодной комнате), известны и случаи (правда, редкие), когда стабильность при 0°С оказывается ниже, чем при комнатной температуре.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТА

 

 

2.1. Объект исследования

 

Каталаза – это гемопротеид, содержащий четыре гемовые группы. Наряду с пероксидазной активностью каталаза способна использовать одну молекулу Н₂O₂  в качестве донора электронов, а другую – как окислитель, т. е. акцептор электронов. Каталаза расщепляет перекись водорода на молекулярный кислород и воду:

ф-т каталаза

2 Н₂O₂ → О₂+2Н₂О

Без катализатора реакция разложения перекиси водорода происходит очень медленно. В присутствии  мелко раздробленной платины эта реакция протекает с высокой скоростью. Но разложение перекиси ферментом каталазой происходит в 10⁷ раз быстрее, чем в случае с неорганическим катализатором платиновой чернью.

Температурный оптимум действия фермента 25ºС, а  при более высоких температурах происходит энергичное окисление фермента и его инактивация.

В работе использовалась каталаза фирмы Sigma из печени животного, лиофилизированная пудра. Каталаза Cat.:60635 C9322-5G. Производство США.

 

 

2.2.Методика эксперимента

 

2.2.1. Определение активности фермента каталазы.

 

Активность  измерялась количеством превращаемого субстрата или образованного продукта в единицу времени при некоторых стандартных, обычно оптимальных для данного фермента условиях. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в одну минуту при 25°С. Удельную активность выражают в единицах активности фермента на 1 мг белка или на 1 мг препарата.

A_уд = Δс/Δτ∙m  [мкмоль/мин∙мг]

Расчет количества H₂O₂, разложенной ферментом, ведем в соответствии с уравнением реакции:

5H₂O₂ + 2KMnO₄ + 3H₂SO₄ → 2MnSO₄ + K₂SO₄ + 5O₂ + 8H₂O

5 H₂O₂ + 2MnO₄ ˉ+ 6H⁺ =5O₂↑ + 2Mn²⁺ + 8H₂O