Кинетика ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой

а) активированием субстрата в результате образования  адсорбционных или молекулярных, обратимо диссоциирующих фермент-субстратных  комплексов;

б) за счет цепных механизмов реакций с участием радикалов или возбужденных молекул, активированных «ударом 2-го порядка».

Оказалось, что  цепные механизмы реакции не играют существенной роли в биологическом  катализе. После установления химической природы ферментов подтвердилось  представление, выдвинутое более 70 лет назад Арни, Михаэлисом и Ментен, о том, что при ферментативном катализе фермент соединяется (в принципе обратимо) со своим субстратом, образуя нестойкий промежуточный фермент-субстратный комплекс, который в конце реакции распадается с освобождением фермента и продуктов реакции. Михаэлис не только постулировал образование промежуточного фермент-субстратного комплекса, но и рассчитал влияние концентрации субстрата на скорость реакции. В процессе реакции различают несколько стадий: присоединение молекулы субстрата к ферменту, преобразование первичного промежуточного соединения в один или несколько последовательных (переходных) комплексов и протекающее в одну или несколько стадий, отделение конечных продуктов реакции от фермента.

Поскольку фермент вступает во взаимодействие с субстратом на очень короткий период, долго не удавалось показать образование такого комплекса. Прямые доказательства существования фермент-субстратного комплекса были получены в лабораториях Кейлина и Чанса. В настоящее время экспериментальные и математические методы кинетики, термодинамики и статистической механики химических реакций позволяют определять для ряда ферментативных реакций кинетические и термодинамические показатели, в частности константы диссоциации промежуточных фермент-субстратных комплексов, константы скорости и равновесия их образования.

В образовании  фермент-субстратных комплексов участвуют  водородные связи, электростатические и гидрофобные взаимодействия, а  также в ряде случаев ковалентные, координационные связи. Информация о природе связей между субстратом и связывающим участком активного центра фермента может быть получена методами электронного парамагнитного и ядерно-магнитного резонанса (ЭПР и ЯМР), а также методами ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии. Для каталитической активности фермента существенное значение имеет пространственная структура, в которой жесткие участки α-спиралей чередуются с гибкими, эластичными линейными отрезками, обеспечивающими динамические изменения белковой молекулы фермента. Этим изменениям придается большое значение в некоторых теориях ферментативного катализа. Так, согласно, гипотезе «индуцированного», или «вынужденного», контакта Кошленда, каталитически активная конфигурация молекулы фермента и соответственно активного центра может в определенных случаях возникать лишь в момент присоединения субстрата в результате его деформирующего воздействия.

В каталитическом процессе существенное значение имеют  точное соответствие между ферментом  и субстратом, а также термодинамические и каталитические преимущества подобного соответствия. Гипотеза «соответствия» предполагает существование между ферментом и субстратом не только пространственной или геометрической комплементарности, но и электростатического соответствия, обусловленного спариванием противоположно заряженных групп субстрата и активного центра фермента. Эта гипотеза не отрицает и участия всей молекулы фермента, которая, вероятнее всего, определяет более узкую субстратную специфичность. Точное соответствие обеспечивает образование эффективного комплекса между субстратом и ферментом.

Подобно другим катализаторам, ферменты, с термодинамической  точки зрения, ускоряют химические реакции за счет снижения энергии  активации. Энергией активации называется энергия, необходимая для перевода всех молекул моля вещества в активированное состояние при данной температуре. Другими словами, это энергия, необходимая для запуска химической реакции, без которой реакция не начинается, несмотря на ее термодинамическую вероятность. Фермент снижает энергию активации путем увеличения числа активированных молекул, которые становятся реакционно-способными на более низком энергетическом уровне.

Таким образом, в механизме ферментативного  катализа ведущую роль играют промежуточные  фермент-субстратные комплексы, образование которых определяется тонкой структурой активного и эффекторного центров и уникальной структурой всей молекулы фермента, обеспечивающими высокую каталитическую активность и специфичность действия биокатализаторов.

 

 

1.3. Кинетика ферментативных реакций

 

 

Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям. Известно, что любая химическая реакция характеризуется константой термодинамического равновесия. Она  выражает состояние химического  равновесия, достигаемого системой, и обозначается K_eq. Так, для реакции:

                                                        к₁

A+B     ↔   C+D                 (1),

                                                        к_-1

K_eq =[C]*[D] /[A]*[B]       (2)

Константа равновесия равна произведению концентраций образующихся веществ, деленному на произведение концентраций исходных веществ. Значение константы равновесия обычно находят из соотношения констант скоростей прямой (k₊₁) и обратной (k_-1) реакций, т. е. K_eq= k₊₁/k_-1. B состоянии равновесия скорость прямой реакции:

υ₊₁= k₊₁ [A]*[B]        (3)

равна скорости обратной реакции:

υ_-1= k_-1 [C]*[D]         (4)

т. е. υ₊₁ = υ_-1 соответственно, k₊₁ [A]*[B] = k_-1 [C]*[D]     (5)

или k₊₁/k_-1= [C]*[D]/[A]*[B], отсюда k₊₁/k_-1= K_eq.          (6)

Таким образом, константа равновесия равна отношению  констант скоростей прямой и обратной реакций. Величину, обратную константе  равновесия (K_eq), принято называть субстратной константой, или, в случае ферментативной реакции, константой диссоциации фермент-субстратного комплекса, и обозначать символом Ks. Так, в реакции:

E + S ↔ ES,

Ks = [E]*[S]/[ES]=k₊₁/k_-1,       (7)

т. е. Ks равна отношению произведения концентрации фермента и субстрата к концентрации фермент-субстратного комплекса или отношению констант скоростей обратной и прямой реакций. Следует отметить, что константа Ks зависит от химической природы субстрата и фермента и определяет степень их сродства. Чем ниже значение Ks, тем выше сродство фермента к субстрату.

При изучении кинетики ферментативных реакций следует учитывать одну важную особенность этих реакций, связанную с явлением насыщения фермента субстратом. При низкой концентрации субстрата зависимость скорости реакции от концентрации субстрата является почти линейной и подчиняется кинетике I порядка. Это означает, что скорость реакции S→Р прямо пропорциональна концентрации субстрата [S] и в любой момент времени (t) определяется следующим кинетическим уравнением:

υ = -d[S]/dt=k′[S],       (8)

где [S]—молярная концентрация субстрата S; -d[S]/dt—скорость убыли субстрата; k′ — константа скорости реакции, которая в данном случае имеет размерность 1/время (мин -¹ или с-¹).

При высокой концентрации субстрата скорость реакции максимальна  и становится постоянной и не зависящей  от концентрации субстрата [S]. В этом случае реакция подчиняется кинетике нулевого порядка и целиком определяется концентрацией фермента. Различают, кроме того, реакции 2-го порядка, скорость которых пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ. В определенных условиях при нарушении пропорциональности говорят о реакциях смешанного порядка.

Изучая явление насыщения, Михаэлис и Ментен разработали общую  теорию ферментативной кинетики. Они  исходили из предположения, что ферментативный процесс осуществляется в виде следующей химической реакции:

^{k+1        k+2}

Е+S↔ЕS→Е+Р,

^k-1

т.е. фермент  вступает во взаимодействие с субстратом с образованием промежуточного комплекса  ЕS, который далее распадается на свободный фермент и продукт реакции Р. Математическая обработка на основе закона действующих масс дала возможность вывести уравнение, названное в честь авторов уравнением Михаэлиса—Ментен, выражающее количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции:

υ =V*[S]/Ks+[S],          (9)

где υ — наблюдаемая скорость реакции при данной концентрации субстрата [S]; Ks — константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, моль/л; V — максимальная скорость реакции при полном насыщении фермента субстратом.

Из уравнения  Михаэлиса—Ментен следует, что при высокой концентраций субстрата и низком значении Ks скорость реакции является максимальной, т. е. υ =V; при низкой концентрации субстрата напротив, скорость реакции оказывается пропорциональной концентрации субстрата в каждый данный момент (реакция 1-го порядка).

Однако следует, указать, что уравнение Михаэлиса—Ментен в его классическом виде не учитывает  влияния на скорость ферментативного  процесса продуктов реакции, например в реакции:

^{k+1          k+2}

Е+S↔ЕS  ↔ Е+Р,

^{k-1           k-2}

и носит несколько ограниченный характер. Поэтому были предприняты попытки усовершенствования его. Так было предложено уравнение Бриггса —Холдейна:

υ =V*[S]/Kм+[S],       (10)

где Kм представляет собой константу Михаэлиса, являющуюся экспериментально определяемой величиной. Она может быть представлена следующим уравнением:

Kм=(k_-1+k₊₂)/k₊₁ или Kм=(k_-1/k₊₁)+(k₊₂/k₊₁)       (11)

В числителе  представлены константы скоростей  распада комплекса ЕS в двух направлениях (в сторону исходных Е и S и в  сторону конечных продуктов реакции Е и Р). Отношение k_-1/k₊₁ представляет собой константу диссоциации фермент-субстратного комплекса Ks. Если

k_-1/k₊₁=Ks,          (12)

то Kм=Ks +(k₊₂/k₊₁).         (13)

Отсюда вытекает важное следствие, что константа  Михаэлиса всегда больше, чем константа диссоциации фермент-субстратного комплекса Ks на величину k₊₂/k₊₁.

Для определения численного значения Kм обычно находят ту концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции и составляет половину от V; т.е. если  υ=1/2V, то, подставляя значение υ в уравнение Бриггса— Холдейна, получаем:

V/2=V*[S]/Kм+[S];           (14)

разделив обе  части уравнения на V, имеем:

1/2 = [S]/Kм+[S]         (15)

или Kм+[S]= 2[S], откуда

Kм=[S]            (16)

Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной. Определение величины Kм имеет важное значение при выяснении механизма действия эффекторов на активность ферментов и т.д. Экспериментальные значения Kм для большинства ферментативных реакций с участием одного субстрата лежат обычно в пределах 10ˉ²—10ˉ⁵М.

Характерным свойством  ферментов является их способность  катализировать определенные химические реакции. При изучении каталитической активности ферментов необходимо основываться на количественной оценке скоростей  катализируемых реакций. Изучение влияния  различных факторов на скорость данной реакции дает возможность делать выводы о механизме действия фермента. В идеальном случае данные кинетических исследований следует сопоставлять с данными, полученными при изучении химии и структуры фермента, чтобы получить более глубокую характеристику изучаемого процесса. Однако это возможно только тогда, когда соответствующий фермент достаточно хорошо очищен. Изучение кинетики действия ферментов важно не только с теоретической, но также и с чисто практической стороны. При выборе единицы активности фермента необходимо, например, знать наилучшие условия его действия, а также то, как влияют на его активность различные факторы. Подобное предварительное изучение кинетики действия обычно необходимо и для успешного осуществления очистки фермента, так как этот процесс должен количественно контролироваться путем систематических определений активности ферментного препарата на разных стадиях очистки.

Хорошо известно, что биологические системы, особенно живые клетки, более чувствительны к изменениям температуры, рН и ряда других факторов, чем большинство химических процессов в небиологических системах, и это является в основном отражением свойств ферментов, от действия которых зависит функционирование биологических систем. Поэтому знание кинетики действия ферментов помогает при анализе многих биологических явлений.

Без данных о  кинетике действия фермента невозможно решить вопрос о химическом механизме  его функционирования или о том, как он действует в клетке.

 

 

1.4. Факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций

 

К числу главных  факторов, определяющих начальную скорость ферментативной реакции, относятся: концентрация фермента, концентрация субстрата, рH, температура присутствие активаторов или ингибиторов, ионная сила.