Генетична інформація, її реплікація, транскрипція і трансляція. Генотоксичний вплив наноматеріалів

Новий фрагмент Оказакі приєднується до відстаючого ланцюга ДНК за допомогою ферменту ДНК-легази, який каталізує утворення фосфодиефірного зв’язку між 3-гідроксильною групою на кінці ДНК, що підлягає подовженню, і 5-фосфатною групою новосинтезованого фрагменту Оказакі. Утворення цього зв’язку вимагає витрати енергії, яка поставляється в ході сполученого гідролізу пірофосфатного зв’язку NAF+ (у бактеріальних клітках) або ATP (у тваринних клітках). ДНК-легазна реакція протікає найбільше ефективно в тих випадках, коли два ферменти, повністю комплементарні матричному ланцюгу ДНК.

 

 

2.13. Необхідність  фізичного поділу ланцюгів батьківської  двухланцюгової ДНК для реплікації

Щоб репліціюючі ДНК ферменти змогли «прочитати» нуклеотидну послідовність матриці, ланцюги батьківської ДНК повинні бути розділені хоча б на короткій ділянці. Навіть якщо бактеріальна ДНК негативно сверхспіралізована, тобто вже злегка розкручена в міру руху реплікативної вилки вперед, вона повинна додатково розплітатися.

Розкручування подвійної  спіралі й утримання двох ланцюгів на деякій відстані один від одного, щоб вони могли реплікуватися, здійснюється за допомогою декількох спеціальних білків. Ферменти, відомі за назвою хеліказ, розплітають короткі ділянки ДНК, що перебувають безпосередньо перед реплікативною вилкою. Для розкручування ДНК потрібна енергія. На поділ кожної пари основ витрачається енергія гідролізу двох молекул ATP до ADP і фосфату. Як тільки невелика ділянка ДНК виявляється розплетеною, до кожного з ланцюгів, що розділилися, міцно приєднуються кілька молекул ДНК-єднального білка (ДЄБ), які перешкоджають утворенню комплементарних пар і зворотному з’єднанню ланцюгів. Завдяки цьому нуклеотидні послідовності ланцюгів ДНК виявляються доступними для репликативної системи. ДНК-полімераза може безпосередньо подовжувати провідний ланцюг, додаючи до її 3-кінця нові нуклеотиди. Інші специфічні білки допомагають примазі одержати доступ до матриці для затримуючого ланцюга. У результаті примаза одержує можливість зв’язуватися з затримуючим ланцюгом і синтезувати РНК-запал для фрагментів Оказакі.

Швидке розкручування  ланцюгів батьківської ДНК у процесі  реплікації (4500 об⁄хв) породжують ще одну проблему, яка полягає в тому, що при відсутності спеціального шарнірного обладнання вся хромосома, розташована спереду реплікативної вилки, повинна обертатися з тою ж швидкістю. Припускають, що уникнути цього клітині допомагає шарнір у ДНК, завдяки якому обертатися з великою швидкістю доводиться тільки короткій ділянці ДНК. Це може бути досягнуте за рахунок короткочасного розриву однієї з ланцюгів ДНК, який дуже швидко й точно відновлюється після одного або декількох оборотів. Короткочасні розриви й з’єднання здійснюються ферментами, відомими за назвою топоізомераз. У прокаріот топоізомераза називається ДНК-геразою. Цей фермент активно закручує ДНК у напрямку, що сприяє розплетенню ланцюгів матриці в районі реплікативноі вилки. Таким чином, гераза допомагає хеліказі розкручувати ДНК для її реплікації. Закручування ДНК за допомогою герази й сполучений із цим процесом гідроліз АТР до ADP і P_t , обумовлюють сверхспіральний стан хромосом. Завдяки геразі всі кільцеві ДНК бактеріальних клітин підтримуються у сверхспіральних формах.

У міру того, як реплікативна вірусам система ліквідує розриви в затримуючім ланцюзі, вона рухається уздовж реплікуючої ДНК. Два нові ланцюги з’єднуються зі своїми комплементарними ланцюгами-матрицями автоматично, утворюючи дві дочірні подвійні спіралі, кожна з яких містить один батьківський і один новосинтезований ланцюг. Для утворення нових спіралей не потрібно ні витрат енергії, не участі якого-небудь ферменту. Дуже важливо відзначити, що процес реплікації протікає зі значно більш високим ступенем точності, чим процеси транскрипції й трансляції. Часті помилки в реплікації піддали б великому ризику збереження видів і їх життєздатність. Помилки ж у транскрипції й трансляції набагато менш небезпечні, оскільки вони впливають на утворення РНК або білка тільки в одній клітині й не змінюють увесь наступний родовід виду.

 

2.14. Протікання реплікації в еукаріотичних клітинах

Процес реплікації еукаріотичної ДНК безсумнівно повинен протікати набагато складніше, чим реплікація ДНК E.coli оскільки в еукаріотичних клітинах одночасно реплікується більше число хромосом, розмір яких суттєво перевищує розмір прокаріотичної хромосоми. До того ж, у силу того, що короткі ділянки еукаріотичної ДНК повинні розміщуватися навколо білкових часток, утворюючи нуклеосоми, які у свою чергу щільно покладені в спіральну структуру, реплікація цієї ДНК, крім розкручування ДНК, повинна супроводжуватися ще механічними й геометричними змінами структури ДНК.

 

15. Транскрибування генів з утворенням РНК

У процесі транскрипції за допомогою ферментної системи  відбувається синтез ланцюга РНК, нуклеотидна послідовність якої комплементарна послідовності однієї з ланцюгів ДНК. Транскрипція повинна здійснюватися точно, оскільки клітці потрібні білки з нормальною генетично детермінованою послідовністю амінокислот. У результаті транскрипції утворюються три класи РНК. По-перше, це матрична РН , яка надходить у рибосоми й там направляє один або декілька поліпептидів, амінокислотна послідовність яких була закодована геном або групою генів у хромосомі.

Матричні РНК – це одноланцюгові молекули самої різної довжини. У прокаріот одна молекула мРНК може кодувати одну, дві й навіть більше число поліпептидних ланцюгів. Якщо вона несе інформацію тільки про один поліпептид, то така мРНК називається моногенню, або моноцистронною; якщо ж вона кодує два або більше число різних поліпептидів, то таку мРНК називають полігенною або поліцестронной. Полігенні мРНК можуть так само містити нетрансльовані міжгенні області, або спесейсери, які розділяють ділянки, що кодують окремі поліпептидні ланцюги, і, очевидно, допомагають регулювати швидкість трансляції.

 

2.16. Синтез матричної РНК при допомозі ДНК-залежної РНК- полімерази

Відкриття ДНК-полімерази й залежності її функціонування від наявності ДНК-матриці привело до пошуку ферментів, які могли б забезпечити синтез ланцюга РНК, комплементарній матриці ДНК. В 1959 році такий фермент, здатний утворювати полімер РНК із рибонуклеозид-5-трифосфат був виділений з бактеріальних екстрактів майже одночасно й незалежно чотирма різними групами американських біохіміків. Цей фермент, що одержав назва ДНК-залежної РНК- полімерази по ряду властивостей, схожий на ДНК-залежну ДНК-полімеразу. РНК-полимеразі необхідні всі чотири рибонуклеозид-5-трифосфата (ATP, GTP, UTP і CTP) у якості попередників нуклеотидних елементів РНК, а також іони Mg²⁺. У якості істотного компонента активного центру вона містить цинк. РНК-полімераза подовжує ланцюг РНК, приєднуючи рибонуклеотидні мономери до 3-гідроксильного кінця молекули РНК, тобто будує ланцюг РНК у напрямку 5→3 з β- і γ- фосфатних груп попередників нуклеозид-5-трифосфатів утворюється неорганічний пірофосфат. РНК-полімераза вимагає для свого функціонування наявність ДНК. Фермент найбільш активний, якщо в якості матриці використовується природна двухланцюгова ДНК із того ж самого або з якого-небудь іншого організму. З 2-х ланцюгів ДНК транскрибується тільки одна. У місця, що відповідають залишкам аденіну ДНК-матриці, у ново синтезовану РНК включаються залишки урацилу, оскільки аденін і урацил утворюють комплементарну пару. У місця, що відповідають залишкам ДНК-матриці включаються залишки адецитозніну. Залишки гуаніну й цитозину в ДНК-матриці визначають включення цитозинових і гуанінових залишків у ланцюг РНК. Аналіз нуклеотидного складу й нуклеотидної послідовності новоствореної РНК показав, що вона має протилежну стосовно матриці полярність і її послідовність комплементарна послідовності матричного ланцюга. В E.coli присутня тільки одна ДНК-залежна Рнк-полімераза, яка здатна синтезувати не тільки мРНК, але також тРНК і рРНК. Вона являє собою великий і складний фермент, що полягає з п’яти поліпептидних субодиниць: двох α- ланцюгів, однієї β-, однієї β’- і однієї ϭ- ланцюги. Структура холофермента цієї полимерази позначається так: α2ββ’ϭ. Перший етап транскрипції- це приєднання холофермента до особливої ділянки ДНК, що називається промотором, яка являє собою коротку послідовність, що пізнається РНК-полімеразою. Як тільки РНК-полімераза зайняла правильне положення в промоторній ділянці й утворила трохи фосфодиефірних зв’язків, субодиниця ϭ відділяється від холофермента. « Кор-фермент», що залишився, продовжує подовжувати молекулу РНК. По закінченню транскібуючого гена, подає сигнал особлива термінуюча послідовність в матриці ДНК. Для припинення транскрипції й відділення РНК-полімерази від ДНК необхідний ще один специфічний білок, позначуваний ρ. Таким чином, синтез РНК включає три етапи: ініціацію, елонгацію й термінацію.

 

17. Проходження подальшого перетворення транскриптів РНК

Транскрипти РНК, синтезовані за допомогою РНК-полімерази, звичайно проходять подальші ферментативні перетворення, названі посттранскрипціонним процессінгом, і тільки після цього вони знаходять свою функціональну активність.

рРНК як еукаріотичних, так і прокаріотичних клітин утворюються з більш довгих молекул-попередників, що називаються прерибосомними РНК.

тРНК також утворюється з більш довгих РНК-попередників у результаті ферментативного видалення зайвих нуклеотидів з 5- і 3-кінців молекули.

 

18. Слугування гетерогенних ядерних РНК попередниками еукаріотичних матричних РНК

Еукаріотичні матричні РНК, що виявляються в цитоплазмі мають три характерні структурні властивості. Перша полягає в тому, що еукаріотичні мРНК є звичайно моногенними молекулами, у той час, як багато прокаріотичних мРНК – полігени. Друга властивість більшості еукаріотичних мРНК полягає в тому, що вони містять на своєму 3-кінці «хвіст» і 100-200 послідовно приєднаних залишків А- А – так званий poly (А)-хвіст. Цей хвіст синтезується окремо з молекул АТР за допомогою поліаденілатполімерази, яка працює в основному так само, як РНК-полімераза, і каталізує наступну реакцію:

nАТР → (АМР) _n + nPP _I

 

Поліаденілатполімеразі не потрібна матриця, однак необхідно мРНК у якості запалу. Третя відмінна риса більшості еукаріотичних мРНК – це наявність у них 5-кінцевого «кепа», що представляє собою залишок 7-метилгуанозіну, приєднаний до 5-кінцевого залишку мРНК досить незвичайним способом, а саме за допомогою трифосфатного зв’язку.

 

19. Зчитування у РНК-утримуючих вірусів ДНК за допомогою зворотної транскриптази

Деякі онкогенні РНК-утримуючі віруси тварин, такі, як вірус саркоми Рауса, мають унікальний фермент – РНК-залежну ДНК-полімеразу, часто названу зворотньою транскриптазой. Після того як такий вірус попадає в клітину-хазяїна, цей фермент здатний каталізувати синтез ДНК, комплементарної стосовно вірусу РНК. У результаті цього утворюється ДНК, яка містить гени, що обумовлюють рак; це ДНК часто закріплюється в геном еукаріотичної клітини-хазяїна, де вона може протягом багатьох поколінь залишатися в схованому, тобто не експресованому стані. За певних умов такі бездіяльні вірусні гени можуть активізовуватися й викликати реплікацію вірусу; при інших же умовах вони можуть сприяти перетворенню такої клітини в ракову.

Завдяки відкриттю Девіда Балтімора, яке дозволило представити, яким чином включаються в геном клітини-хазяїна онкогени, що перебувають у РНК-утримуючих вірусів у вигляді РНК, довелося по-іншому сформулювати центральну догму молекулярної біохімії. РНК-утримуючі віруси, що володіють зворотною транскриптазой називають ретровірусами.

Зараз накопичується  багато даних про те, що в ДНК багатьох видів тварин присутні гени, що беруть початок від РНК-утримуючих вірусів, навіть якщо тварини, з яких ця ДНК виділена, самі не зазнали впливу таких вірусів. Вважають, що гени ряду РНК-утримуючих вірусів колись, можливо на ранніх стадіях біологічної еволюції цих видів, транскрибувалися в ДНК і вмонтувалися в хромосоми предків цих тварин. Після цього вони передавались із покоління в покоління при реплікації всієї ДНК клітини, у тому числі, й утримують в ній онкогени, що спочатку належали вірусній РНК.

 

Висновок

Ферменти та інші білки, що беруть участь у процесах реплікації й транскрипції ДНК, належать до самих  дієвих із усіх відомих біологічних каталізаторів. Вони здатні створювати гігантські макромолекули з мононуклеїдів- попередників, використовуючи енергію фосфатної групи й з винятковою точністю здійснювати перенос генетичної інформації від матриці до новосинтезованої мережі.

Крім того, при роботі цих ферментів повинні вирішуватися складні механічні проблеми, оскільки, перш ніж у справу вступлять реплецируючі ферменти, повинно відбутися розплітання батьківської двухланцюгової ДНК так, щоб ферменти могли одержати доступ до інформації, закодованої в послідовності основ усередині подвійної спіралі. Більше того, в еукаріотичних клітинах система реплікації тісно зв'язана зі складною тривимірною організацією хроматину й нуклеосом.

Ферменти транскрипції так само мають незвичайні властивості. Вони здатні не тільки каталізувати синтез широкого набору різних РНК, але й починати й закінчувати свою дію в особливих точках хромосоми, реагуючи на різноманітні регуляторні сигнали. У результаті погодженої дії ферментів на певних етапах життєвого циклу клітки транскрибують тільки певні гени. Таким чином, ДНК і РНК - полімерази, як, втім, і інші білки, що допомагають здійснювати реплікацію й транскрипцію ДНК, життєво важливі для збереження в поколіннях генетичної інформації.

 

 

 

 

 

РОЗДІЛ 3

ГЕНОТОКСИЧНІСТЬ НАНОМАТЕРІАЛІВ

3.1. Генотоксичні  властивості наноматеріалів

Наноматеріали (НМ) активно впроваджуються в наше життя. Особливої уваги заслуговують нові, сконструйовані НМ: фулерени, вуглецеві нанотрубки, квантові точки, наночастинки. Існують і природні речовини, які вивчалися токсикологами, але тільки недавно віднесені до НМ. Подібно новим хімічним сполукам НМ повинні пройти оцінку генетичної безпеки.

НМ характеризуються особливостями, що дозволяють припустити їх генотоксичну дію: високою проникністю на організмовому, органному, тканинному й клітинному рівнях; індукцією вільних радикалів, у тому числі активних форм кисню й азоту; ушкодженням цитоскелета; здатністю деяких НМ долати каріолему й розташовуватися в ядрі клітки; кон'югацією із ДНК; складом деяких НМ, що включають атоми хімічних сполук, що володіють канцерогенною дією, наприклад кадмію або миш'яку; подібністю в будові деяких НМ із волокнами азбесту, який має генотоксичну і канцерогену дію.