Генетична інформація, її реплікація, транскрипція і трансляція. Генотоксичний вплив наноматеріалів

Спочатку вважали, що реплікація починається  у фіксованій точці ДНК (вона називається точкою початку реплікації) і що єдина реплікативна вилка рухається по кільцевій молекулі ДНК в одному напрямку (Дод.Б, схема Б.3). Однак наступні експерименти, проведені на хромасомах E.coli і вірусах, показали, що реплікація звичайно відбувається у двох напрямках, тобто існують дві реплікативні вилки. Обидві вилки виникають в одній точці й віддаляються від неї в обох напрямках одночасно поки знову не зустрінуться (Дод.Б, схема Б.3). У цій точці два повністю синтезовані дочірні двухланцюгові кільця розділяються: кожне з них містять один старий і один новий ланцюг.

Ділянка початку реплікації являє  собою нуклеотидну послідовність довжиною 100-200 пар основ, без якої ДНК не може реплікуватися. Ця послідовність упізнається специфічними клітинними білками, які починають на цім місці цикл реплікації. Саме цей процес ініціації реплікації перебуває під контролем клітинної регуляції.

Виходячи зі швидкості  руху реплікованої вилки E.coli, можна заключити, що при 37°С нова ДНК синтезується зі швидкістю понад 45000 нуклеотидних залишків за хвилину в розрахунку на одну вилку. Оскільки на кожний повний виток подвійної спіралі приводиться ≈ 10 пара основ, швидкість розплітання батьківської ДНК у реплікованій вилки в клітинах E.coli становить більш 4500 об⁄хв, що перевищує швидкість обертання вала в двигуні автомобіля, що мчиться зі швидкістю 110 км⁄ч. Очевидно, що настільки швидке розплітання повинне створювати ряд механічних проблем для реплікації у виді двухланцюгової природи нативних молекул ДНК.

2.3. . Багатоточковість початку реплікації в еукаріотичних ДНК

В еукаріотичних ДНК багато точок початку реплікації. Очевидно, реплікація еукаріотичної ДНК, яка організована нуклеосоми й перебуває в складі хроматинових волокон, повинна бути набагато більш складною, чим реплікація бактеріальної хромосоми. Щоб з’ясувати, як протікає реплікація ДНК в еукаріот, були проведені радіоавтографічні експерименти, аналогічні дослідам Кернса по реплікації E.coli. Ці експерименти показали, що еукаріотична ДНК також реплікується у двох напрямках, але реплікативні вилки рухаються дуже повільно, в 10 разів повільніше, чим в E.coli. Якби на кожну хромосому доводилася тільки одна пара реплікативних вилок, то через більші розміри еукаріотичних ДНК їх реплікація тривала б майже 2 місяця. Виявилося, що реплікація еукаріотичної ДНК починається одночасно в багатьох точках (число яких, імовірно, перевищує 1000). З кожної такої точки одночасно в протилежних напрямках рухаються дві реплікативні вилки (Дод.Б, схема Б.4), завдяки чому реплікація цілої еукаріотичної хромосоми може завершитися навіть швидше, чим реплікація бактеріальної хромосоми. Оскільки в еукаріотичній клітині хромосом багато, усі вони повинні реплікуватися одночасно. Таким чином, у ядрі еукаріотичної клітини працює одночасно багато тисяч реплікованих вилок.

2.4. Реплікація ДНК по механізму « кільця, що котиться «

ДНК деяких вірусів реплікується в одному напрямку по механізму         «кільця, що котиться», варіант якого представлений на схемі (Дод.Б, схема Б.5). На початку один із двох ланцюгів кільцевої батьківської ДНК розщеплюється ферментом. Потім до третього кінця розщепленого ланцюга приєднується трохи нових нуклеотидів. Ріст нового ланцюга на кільцевій матриці здійснюється за рахунок поступового витиснення п’ятикінцевої частини розщепленого ланцюга з кільцевої матриці, що котиться. У міру росту нового ланцюга витиснутий п’ятий хвіст стає лінійною матрицею для синтезу нового комплементарного ланцюга. Цей синтез на лінійній матриці триває доти , поки не утворюється дочірній ланцюг ДНК, комплементарний одному обороту кільцевої матриці. Двухланцюговий хвіст відщеплюється потім за допомогою ферменту, і на п’ятому кінці знову може починатися процес реплікації. Таким чином, з кільцевої матриці може сходити безліч комплементарних копій кільцевої ДНК. Механізм « кільця, що котиться, « використовується в ооцитах у процесі синтезу генів рРНК; він дозволяє одержати велику кількість копій цих генів, розташованих у тандемній послідовності, що у свою чергу дає можливість синтезувати одночасно багато рРНК. Цей механізм необхідний ооцитам для того, щоб виробляти багато рибосом для швидкого синтезу клітинних білків у процесі прискореного росту ембріона на ранніх стадіях розвитку.

2.5. Вміст в  бактеріальних екстрактах ДНК-полімерази

Уперше механізми дії  ферментів при реплікації стали  доступні прямому біохімічному дослідженню завдяки важливим роботам Артура Корнберга і його колег, початим в 1956 році. Вони інкубували екстракти із кліток E.coli із сумішшю dATP, dTTP, dGTP і dCTP – фосфорна група яких була позначена ізотопом ³²Р. Було виявлено, що при цьому синтезується дуже невелика кількість нової ДНК, що містить у своїх фосфатних групах ізотоп ³²Р. Фермент, катілізуючий цю реакцію й названий ДНК-полімеразой I, був зрештою очищений і його властивості були докладно вивчені. Виявилося, що він каталізує послідовне приєднання дезоксирибонуклеотидних залишків до кінця ланцюга ДНК із одночасним вивільненням неорганічного пірофосфату, що містить β- і γ- фосфатні групи кожного, що вбудовуються в дезоксирибонуклеозид-пятитрифосфат. Рівняння реакції в найпростішій формі має вигляд

(dNMP)_n+ dNTP (dNMP)_n+1  +PP_i

ДНК                   видовженна

                                ДНК

де dNMP і dNTP означають відповідно дезоксирибонуклеозид-5- монофосфат і дезоксирибонуклезиод-5-трифосфат.Якщо хоча б один з 4-х попередників відсутній, то нове ДНК не утворюється, тобто синтез нової ДНК іде тільки в присутності всіх 4-х попередніх компонентів.5-трифосфаты всіх 4-х дезоксирибонуклеозидів не можуть бути замінені відповідними 5-дифосфатами або 5-монофосфатами; фермент не працює також з рибонуклеозид-5-трифосфатами. Для роботи ДНК-полимеразі необхідні іони Mg²⁺ , а в її активному центрі міститься міцно зв’язаний з ферментом іон Zn²⁺.

ДНК-полімераза каталізує ковалентне зв’язування нових дезоксирибонуклеотидів, яке відбувається завдяки приєднанню їх α – фосфатних груп до вільного 3-гідроксильного кінця попереднього ланцюга ДНК; отже, синтез ланцюга ДНК відбувається в напрямку 5→3. Енергія, затрачувана на утворення кожного нового фосфодиефірного зв’язку в основі ДНК, забезпечується розщепленням пірофосфатного зв’язку між α- і β- фосфатними групами попередніх компонент – дезоксирибонуклеозид-5-трифосфатів. Пірофосфат, що утворюється при цьому, руйнується потім до фосфату, який може зрушувати реакцію убік її завершення. У процесі роботи було зроблено дуже важливе спостереження: було відзначено, що ДНК-полимеразна реакція протікає тільки в тому випадку, якщо в системі вже перебуває деяка кількість попередньої двухланцюгової ДНК.

2.6. Дія ДНК-полімерази відбувається тільки за участю попередньої ДНК

Корнберг і його колеги, вивчаючи питання про те, навіщо ДНК-полимеразі необхідна присутність ДНК, показали, що ця ДНК виконує в полимеразній реакції дві найважливіші функції – вона служить запалом і матрицею.

А) Один із ланцюгів попередньої ДНК служить запалом

ДНК-полімераза послідовно додає нуклеотиди до 3-кінця одного з ланцюгів, що служить запалом. Отже, синтез нового ланцюга ДНК відбувається в напрямку 5→3. ДНК-полімераза не в змозі сама по собі без запалу почати синтез нової ДНК; вона здатна тільки подовжувати вже існуючий ланцюг, причому навіть це вона може дати тільки в присутності ланцюга, що відіграє роль матриці.

Б) Інший ланцюг попередньої ДНК служить матрицею

Нуклеотиди приєднуються до ланцюга запалу відповідно до нуклеотидної послідовністі ланцюга – матриці за принципом комплементарного спарювання Уотсона- Лемента. Де б не перебував у матричному ланцюзі залишок тімину, у дочірньому ланцюзі в цім місці вбудовується залишок адеміна, і навпаки. Аналогічно, якщо в ланцюзі-матриці стоїть залишок гуаніну, то напроти нього в дочірньому ланцюзі буде вбудований залишок цитозину, і навпаки. Таким чином, продукт ДНК-полимеразної реакції – це дуплекс із комплементарно спареними основами.

Оскільки ДНК-полимеразі необхідні як ланцюг-запал, так і вільний ланцюг-матриця, цей фермент може здійснювати реплікацію цілої нативної хромосоми, якщо остання є двухланцюговим кільцем, одноланцюговим кільцем або інтактним лінійним дуплексом, у якім спарені всі основи. У зв’язку з обов’язковою вимогою для роботи ДНК-полимеразі запалу й матриці виникло багато принципових питань щодо ініціації й елонгації синтезу ланцюгів ДНК.

2.7. Наявність  багатьох ферментів і білкових  факторів для реплікації ДНК

Ранні дослідження Корнберга і його колег відкрили шлях до прямого вивчення реплікації ДНК, однак і донині в нас немає повної й детальної картини процесу реплікації, навіть у випадку вірусної ДНК, що утворює одну невелику хромосому. Сьогодні завдяки зусиллям Корнберга й багатьох інших дослідників ми знаємо, що для реплікації необхідна не тільки ДНК-полімераза. У цьому процесі, очевидно, бере участь більше 20 різних ферментів і білків, кожний з яких виконує певну функцію. Реплікація складається з великої кількості послідовних етапів, які включають пізнання точки початку реплікації, розплітання батьківського дуплекса, утримання його ланцюгів на достатній відстані один від одного, ініціацію синтезу нових дочірніх ланцюгів, їх елонгацію, закручування ланцюгів у спіраль і, нарешті, термінацію реплікації. Усі ці етапи процесу реплікації протікають із дуже високою швидкістю й винятковою точністю. Увесь комплекс, що полягає в більш ніж з 20 реплікативних ферментів і  факторів, називають ДНК – реплікозною системою, або реплісомой. Розглянемо загалом основні етапи процесу реплікації в тому виді, у якому вони відомі нам на сьогоднішній день.

2.8. Наявність  трьох ДНК-полімераз у клітинах E.coli

Клітини E.coli містять три різні ДНК-полімерази, позначувані I, II, і III. Найбільше широко розповсюджена з них – це ДНК-полимераза I, той фермент, який був описаний вище. Хоча Корнберг показав, що цей фермент здатний реплікувати у пробірці цілу молекулу ДНК дрібного вірусу øХ184 з утворенням біологічно активної ДНК, ми знаємо, що ДНК-полімераза I це не головний фермент, що здійснює елонгацію ДНК у клітині. ДНК-полімераза I дійсно бере участь у реплікації, але, як ми побачимо пізніше, особливим чином.

У контактних клітинах E.coli за елонгацію ланцюга ДНК відповідає головним чином ДНК-полімераза III. Вона функціонує у формі великого комплексу з мол. масою 550000, що називається холоферментом ДНК-полімерази III. Цей комплекс містить у своєму складі іон Zn²⁺ і вимагає для роботи наявність іонів Mg²⁺ . Йому також необхідні матриця й запал, без яких він не може ініціювати процес реплікації. Подібно до ДНК-полімерази I, він подовжує ДНК у напрямку 5→3, приєднуючи нові нуклеотиди до 3-кінцю ланцюга-запалу. Холофермент складається з декількох субодиниць. Субодиниця β, або полімераза III, необхідна для пізнання й зв’язування ланцюга запалу, роль якого виконує батьківська ДНК. Як тільки холофермент приєднується до правильного місця ініціації, полімераза III вивільняється з комплексу. Елонгацію ланцюга дочірньої ДНК здійснює комплекс, що залишився, ДНК-полімераза III. Обоє фермента – ДНК-полимераза I і ДНК-полімераза III – мають три ферментативними активностями. Крім полімеразної активності вони мають 5→3  і 3→5 – екзонуклеазні активності, тобто вони можуть відщеплювати кінцеві нуклеотиди з будь-якого кінця ланцюга ДНК. Функція ДНК-полімерази II поки не відома.

2.9. Одночасна  реплікація обох ланцюгів ДНК  створює проблеми

Одна із проблем пов’язана з тим, що ДНК-полимерази здатні приєднувати нові мономери тільки до 3-кінця ДНК. Ми вже бачили, що при реплікації хромосоми E.coli обидва ланцюги в місці знаходження репликативної вилки реплікуються одночасно. У цей ж час ми знаємо, що у двухланцюгової ДНК ланцюги антипаралельні. Це означає, що ріст дочірніх ланцюгів, також повинен проходити антипаралельно. У реплікативній вилці перебуває 3-кінець одного зростаючого ланцюга й 5-кінець іншого. З того, що ДНК-полімераза може приєднувати нуклеотиди тільки до 3-кінця й не може приєднувати до 5-кінця, випливає, що ДНК-полімераза здатна подовжувати одну із двох зростаючих ланцюгів у напрямку руху реплікативної вилки. Тоді можуть виникнути питання. Можливо, існують два класи ДНК-полімерази, і представники одного з них приєднують залишки тільки до 3-кінця, а іншого – тільки до 5-кінця? Або ж існує така ДНК-полімераза, яка може подовжувати ланцюг як з 5-, так і з 3-кінця? Або ж, нарешті, один з ланцюгів реплікується ферментами, що рухаються в напрямку, протилежному напрямку руху реплікативної вилки?

2.10. Відкриття  фрагментів Оказакі

Відповідь на всі ці питання  дало важливе спостереження, зроблене Рейджи Оказакі з Японії, який виявив, що в ході реплікації ДНК E.coli і інших бактерій більша частина новоствореної ДНК виявляється у формі невеликих шматочків. Ці шматки, що одержали назву фрагментів Оказакі, містять приблизно 1000-2000 нуклеотидних залишків. Оказакі припустив, що ці фрагменти являють собою короткі відрізки молекули ДНК, що утворюються в результаті переривчастої реплікації, й потім з’єднуються один з одним в один ланцюг. Завдяки цьому відкриттю вдалося показати, що один з ланцюгів ДНК реплікуються неперервно в напрямку 5→3, тобто в напрямку руху реплікативної вилки; цей ланцюг називається провідним. Інший же ланцюг синтезується переривчасто з утворенням коротких ферментів, так само за рахунок приєднання нових маномерів до 3-кінця тобто в напрямку протилежному  репликативній вилці. Потім фрагменти Оказакі за допомогою ферментів змішуються один з одним, утворюючи другий дочірній ланцюг, що називається що відростаючим. Фрагменти Оказакі утворюються не тільки в бактеріальних, але й у тваринних клітинах, правда в останніх вони набагато коротше – їх довжина не перевищує 200 нуклеотидних залишків.

2.11. Необхідність  РНК-запалу для синтезу фрагментів  Оказакі

Для утвору фрагментів Оказакі в клітинних екстрактах необхідна присутність не тільки dATP, dGTP, dCTP і dTTp, але також і суміші рибонуклеозид-5-трифосфатів (ATP, GTP, CTP і UTP). Ці й інші спостереження навели на думку, що для синтезу ДНК якимсь чином необхідний синтез РНК. Для синтезу фрагмента Оказакі в якості запалів потрібні короткі відрізки РНК, комплементарні етро віру ланцюгу ДНК. Ця РНК утворюється в напрямку 5→3 з ATP, GTP. CTP і UTP за допомогою ферменту, що називається примазою. До 3-кінця цього короткого одноланцюгового РНК-запалу й приєднуються один за одним дезоксирибонуклеотидні залишки, комплементарні ланцюгу-матриці ДНК. Звичайно РНК-запал складається з декількох рибонуклеотидних залишків, до яких потім ДНК-полімераза III приєднує 1000-2000 дезоксирибонуклеотидних залишків, і в результаті утворюється фрагмент Оказакі. Після завершення синтезу фрагмента Оказакі РНК-запал віддаляється, нуклеотид за нуклеотидом, за допомогою 5→3 екзонуклеазної активності ДНК-полимерази I. У міру відщіплення рибонуклеотидних мономерів кожний з них заміщається на відповідний дезоксирибонуклеотид у ході полімеразної реакції, що здійснються ДНК-полимеразой I. Однак, ДНК-полімераза I не може зробити останнє ковалентне приєднання фрагменту Оказакі до зростаючого ланцюга ДНК; для цього потрібно інший фермент.

2.12. Фрагменти  Оказакі з’єднуються один з одним за допомогою ДНК-легази