Производство ферментов в пищевой промышленности

Московский Государственный  Машиностроительный Университет 
(МАМИ) 

 

 

 

КУРСОВАЯ РАБОТА 
на тему "Производство ферментов в пищевой промышленности."

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Студентка: Гайдукова В.А. 
группа Н-34 
Преподаватель: Мальцевская Н.В.

 

 

 

 

 

 

 

Москва 
2013

Содержание 
  Введение  
1. Характеристики применяемых м-ов. 
2. Описание и обоснование технологических стадий производства.

2.1.Приготовление питательных  сред.

2.2. Приготовление посевного  материала .

2.3.Производственное культивирование. 
3.Выделение продукта.  
4. Очистка и концентрирование продукта. 
5. Технологическая схема получения кристаллов альфа-амилазы.

6.Получение готовой формы  продукта .

7.Описание препарата и  его особенности.

8.Очистка стоков и выбросов. 
Заключение  
Список литературы  
 

Введение.

Ферменты присутствуют во всех живых клетках и способствуют превращению одних веществ (субстратов) в другие (продукты). Ферменты выступают в роли катализаторов практически во всех биохимических реакциях, протекающих в живых организмах. К 2013 году было описано более 5000 разных ферментов. Они играют важнейшую роль во всех процессах жизнедеятельности, направляя и регулируя обмен веществ организма.

Основную часть ферментов, получаемых промышленным способом, составляют гидролазы. К ним относятся, в  первую очередь амилолитические ферменты: α-амилаза, β-амилаза, глюкоамилаза. Их основная функция - гидролиз крахмала и гликогена. Крахмал при гидролизе расщепляется на декстрины, а затем до глюкозы. Эти ферменты применяются в спиртовой промышленности, хлебопечении.

Амила́за (англ. Amylase) — фермент, гликозил-гидролаза, расщепляющий крахмал до олигосахаридов, относится к ферментам пищеварения. В истории амилаза стала первым открытым ферментом, когда французский химик Ансельм Пайен описал в 1833 году диастазу, фермент, расщепляющий крахмал до мальтозы. Согласно другим данным, амилазу в 1814 году открыл академик петербургской Академии наук К. Г. С. Кирхгоф. Именно амилаза приводит к появлению сладковатого вкуса при длительном пережёвывании крахмалосодержащих продуктов (например, из риса или картофеля), но без добавления сахара. Амилаза присутствует в слюне (птиалин), где начинает процесс пищеварения. 

α-Амилаза (КФ 3.2.1.1; 1,4-α-D-глюкан-глюканогидролаза; гликогеназа) является кальций-зависимым ферментом. К этому типу относятся амилаза слюнных желез и амилазаподжелудочной железы. Она способна гидролизовать полисахаридную цепь крахмала и других длинноцепочечных углеводов в любом месте. Таким образом, процесс гидролиза ускоряется и приводит к образованию олигосахаридов различной длины. У животных α-амилаза является основным пищеварительным ферментом. Активность α-амилазы оптимальна при нейтральной pH 6,7-7,0. Фермент обнаружен также у растений (например, в овсе), в грибах (в аскомицетах и базидиомицетах) и бактериях (Bacillus).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.Характеристика применяемых м/ов

Aspergillus oryzae – грибок из рода Aspergillus, порядок Deuteromicetes или несовершенных, не имеющих половой стадии. Народы Востока давно использовали Aspergillus oryzae для получения соевого соуса.  
Благодаря способности вырабатывать различные ферменты, грибы Aspergillus представляют большой интерес для промышленности. Известно, что в подходящих для брожения условиях они способны продуцировать широкий спектр ферментов, пригодных для промышленного и пищевого производства. В том числе альфа-амилазу. 
Амилолитические ферменты получают как продукт биосинтетической деятельности грибов или бактерий (1, 2). Ферментные препараты, полученные на основе микробиологического синтеза, имеют разные области применения. Так, бактериальные продуценты, например, Bacillus subtilis 82 (2) синтезируют α-амилазы, имеющие оптимум действия в области значений рН 6,0-7,5. Их, как правило, используют в производствах, где технологический процесс проходит в нейтральной зоне рН.

Грибные продуценты синтезируют кислые α-амилазы, проявляющие высокий уровень активности при значениях рН 4,5-5,5 и обладающие не только разжижающим действием, как бактериальные α-амилазы, но и осахаривающим. Поэтому кислые α-амилазы широко используют в хлебопекарном и бродильных производствах.

В связи с этим селекция новых  грибных штаммов для получения  кислой α-амилазы актуальна.

Известен штамм - активный продуцент  кислой α-амилазы из рода аспергиллов - Aspergillus oryzae 740-A-2 (3), при твердофазном культивировании которого синтезируется кислая α-амилаза. К недостатку этого продуцента относится то, что он синтезирует α-амилазу с высоким уровнем активности при поверхностной ферментации.

Известен штамм Aspergillus oryzae 3-9-151 (4), обладающий способностью к синтезу α-амилазы при глубинном культивировании с уровнем активности в культуральной жидкости 3-4 ед. АС/см³. Однако этот штамм характеризуется низкой продуктивностью при глубинном культивировании.

Наиболее близким к заявляемому  объекту является штамм Aspergillus oryzae 387 - один из наиболее активных продуцентов кислой α-амилазы. В глубинной культуре известных штаммов Aspergillus oryzae 387 на 48 часов роста амилолитическая активность достигает 12-19 ед. АС/см³ в зависимости от условий культивирования (5).

Недостатком этого штамма является низкий уровень амилолитической активности культуральной жидкости и длительность ферментации.

    Задачей, поставленной настоящим изобретением, является получение штамма гриба Aspergillus oryzae, обладающего высокой способностью к образованию кислых амилаз, проявляющих максимальную активность в кислой и слабокислой зоне рН.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма Aspergillus oryzae 4150, заключается в получении кислой α-амилазы с высокой активностью в культуральной жидкости (25-40 ед. АС/см³), превышающей аналог в 2-3 раза при сокращении длительности процесса культивирования.

Задача решается созданием нового штамма путем селекции и мутагенеза из известного штамма Aspergillus oryzae 387, способного к быстрому росту на простых по составу питательных средах.

Заявляемый штамм Aspergillus oryzae 4150 получен путем многоступенчатой селекции и мутагенеза с использованием химических и физических мутагенов, в частности ультрафиолета и этиленимина, депонирован в ВКПМ под №F-930.

Изучали уровни продукции амилаз в  культуральной жидкости, полученной путем выращивания заявляемого штамма и известного штамма в жидкой питательной среде с аэрацией и перемешиванием. Сопутствующими ферментами при этом являлись кислые протеазы и ксиланаза. Сравнительные показатели уровней амилолитической активности культуральной жидкости штамма Asp.oryzae 4150 с прототипом представлены в табл.1.Таким образом, в результате селекции и мутагенеза получен новый штамм Aspergillus oryzae 4150, обладающий высоким уровнем синтеза α-амилазы и сокращенной длительностью процесса культивирования, что позволяет повысить технологичность процесса получения ферментов кислых амилаз при использовании штамма Aspergillus oryzae 4150. Штамм отличается от известного и по культурально-морфологическим признакам.

Штамм хранится в виде лиофильно-высушенной культуры на косяках с сусло-агаром в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии г. Москвы.

Штамм Aspergillus oryzae 4150 характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки. Через 6 суток роста на сусло-агаре образуются колонии диаметром 80×80 мм, поверхность колонии пушистая, профиль колонии конусовидный, форма колонии округлая, края волнистые, цвет - белый, с возрастом цвет колонии сереет. Цвет с обратной стороны - песочный.

При росте на агаризованной среде Чапека размер колонии через 6 суток 55×55 мм, цвет ярко-белый, форма колоний округлая, края волнистые.

На всех средах наблюдается слабое спорообразование, пигменты в среду  не выделяются, эксудата нет, слабый запах плесени.

Морфология штамма. Мицелий гриба  тонкий, разветвленный, конидии формируются  экзогенно; поверхность конидий  гладкая, форма, в основном, округлая; толщина гиф 2-4 мкм.

Физиолого-биохимическая характеристика. Тип катаболизма - дыхание. Отношение  к кислороду - аэроб. Оптимальная  температура роста 30-32°С, максимальная - 50°С, минимальная - 18°С. Оптимальное значение рН среды для роста гриба и биосинтеза ферментов 5,4; рост продуцента имеет место в зоне рН от 2,5 до 10,0.

В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин, галактозу. Продуцент ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки.

Штамм непатогенный.

Штамм Aspergillus oryzae 4150 использовали для получения кислой α-амилазы.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Штамм Aspergillus oryzae 4150 культивируют на питательной среде следующего состава, %:

-пшеничная мука - 6,0;

-пшеничные отруби - 2,0;

- К₂HPO₄ - 1,5;

-остальное - водопроводная вода (среда 4),

- рН - естественный.  

Ферментационную питательную среду  засевают вегетативным посевным материалом в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см³, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 30-32°С в течение 42 часов. Активность внеклеточной α-амилазы составляет 40,0 ед. АС/см³.

При разработке процесса биосинтеза a-амилазы культурой Aspergillus oryzae замена сахарозы (как источника углерода) на крахмал увеличила активность фермента в 3 раза, добавление солодового экстракта (из проросших семян злаковых) ещё в 10 раз, а повышение концентрации основных элементов питательной среды на 50% - ещё в 2 раза.

Штамм	Длительность культивирования, час	Амилолитическая активность, ед. АС/см3
387	48	12,0
387	120	19,0
107	42	33,6

Таблица№1

Сравнительная оценка физиологической                                                    активности грибов Aspergillus oryzae - продуцентов кислой α-амилазы.

2.Описание и  обоснование технологических стадий  производства.

Для получения  данного фермента мы используем глубинный метод производства.

В этом случае микроорганизмы выращиваются в жидкой питательной  среде. Технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается автоматизации и механизации. Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтрата перед его выделением.

При глубинном культивировании  продуцентов ферментов выделяют, как и в любом биотехнологическом процессе, 5 этапов.

2.1. Приготовление питательных сред.

Некоторые предварительно измельчают, отваривают или гидролитически расщепляют. Готовые к растворению компоненты подают при постоянном помешивании в емкость для приготовления среды в определенной последовательности. Стерилизацию среды проводят либо путем микрофильтрации с помощью полупроницаемых мембран, либо при помощи высоких температур. Время обработки в этом случае зависит как от интенсивности фактора, так и от уровня обсемененности объекта. Стерилизуются также все коммуникации и аппараты. Воздух очищается до и после аэрирования. До - потому что содержит частицы пыли органической и неорганической природы, после - так как несет клетки продуцента.

2.2. Получение посевного материала.

Для получения посевного  материала микроорганизм-продуцент пересевают в пробирки на скошенную агарезованную питательную среду. 
Штамм Aspergillus oryzae выращивают при температуре 28-32°С до обильного кониднеобразования. Водную суспензию культуры выращенную на твердой питательной среде , из расчета 1-5% пересевают на жидкую питательную среду (50-100 мл) в колбы 750 мл. Культивирование Aspergillus oryzae происходит на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 30-32 °С в течение 42 часов. Выращивание происходит при указанный выше  температурах и при непрерывном перемешивании и аэрации стерильным воздухом. Расход воздуха на 1 м³ аэрируемой жидкости обычно составляет 60 м³/ч. Необходимое количество посевного материала зависит от физиологических показателей микроорганизма-продуцента . Например, если продуцент обильно образует споры , то расход посевного материала уменьшается ,и наоборот ,увеличивается, если микроорганизмы размножаются вегетативно.Для актиномицетов расход посевного материала может быть 5-20 % , а для спороносных бактерий около 1 % .

2.3. Производственное культивирование.

Биосинтез ферментов в  глубинной культуре протекает в  течение 2-4 суток при непрерывной  подаче воздуха и перемешивании. Высокая концентрация питательных веществ на первых этапах могут тормозить рост биомассы продуцента, поэтому часто свежая среда или некоторые её компоненты вводятся в ферментер на стадии активного роста. Температурный оптимум находится в интервале 22-32 °С. В современных технологических процессах ведется непрерывное автоматическое определение содержания в среде углеводов, количества образовавшихся метаболитов и концентрации клеток. Данные поступают в компьютер, который определяет стратегию коррекции процесса и автоматически регулирует его. Этим достигается максимальная производительность и наилучшее качество продуктов.