Выделение и клонирование генов

 
Рис. 5. 5. Неоплодотворенная (1) и дегенерированная (2) яйцеклетки, нормально развитые морула (3) и бластоциста (4)

 
Яйцеклетки для культивирования in vitro получают из яичников коров, убитых на мясокомбинате, методом рассечения фолликулов в среде Хенкса с добавлением 1% фетальной сыворотки, 1 ед/мл гепарина и 5 мкг/мл гентамицина. Используют морфологический, цитологический и цитогенетический методы оценки их качества. 
Нормально развитые эмбрионы имеют неповрежденные, равномерные по ширине, опалесцирующие оболочки и бластомеры в состоянии дробления, соответствующие возрасту эмбриона. К 5 -7-му дню развития они обычно достигают стадии морулы (рис 5.5.;3). 
Прозрачная зона нормальных морул имеет форму сферы.

Удваивание числа бластомеров в морулах происходит через каждые 24 часа. Различия в степени дробления эмбрионов в ранний период их развития могут быть обусловлены растянутостью сроков овуляции. Бластомеры морул не обязательно должны иметь одинаковую величину, что зависит от возможной асинхронности процесса их деления. На 7-8-й день после осеменения коров-доноров в промывной жидкости обнаруживаются бластоцисты. 
Нормальная ранняя бластоциста (рис. 5.5;4) имеет толщину прозрачной оболочки, примерно, 12 мкм, число бластомеров может быть от 80 до 120, просматривается небольшая полость бластоцисты.

Поверхность клеточной массы – гладкая, равномерная, что указывает на наличие соединительного комплекса между клетками трофобласта, перивителлиновое пространство маленькое. 
Морфологически нормальная поздняя бластоциста на стадии экспандирования – выхода из прозрачной оболочки (8,5 дней после осеменения) характеризуется следующими показателями: прозрачная оболочка утончена, растянута, имеет форму правильной сферы; полость бластоцисты большая;  перивителлиновое пространство отсутствует. 
На 9-й день развития прозрачная оболочка бластоцисты отсутствует, бластополость сохранена, клетки четко выражены (рис. 5.6;1). 
Условно пригодными к пересадке можно считать эмбрионы с небольшими морфологическими изменениями (рис. 5.6.2): 
1. С невыраженной неравномерностью дробления бластомеров. 
2. Небольшим их сжатием. 
3. С включениями в перивителлиновом пространстве. 
4. С нарушениями прозрачной оболочки. 

Рис. 5.6. Стадии развития и качество эмбрионов

Ооциты яичников, выбракованных высокопродуктивных коров могут быть резервом получения эмбрионов для трансплантации. Для этого необходимо добиться их созревания в специальной среде до стадии метафазы II, когда они окажутся способными к оплодотворению in vitro.

 Ооциты, выделенные из поверхностных  фолликулов разного размера и  из яичников коров в охоте  окружены слоем фолликулярных  клеток (рис. 5.6; 3). 

Овоплазма морфологически нормальных ооцитов – это гранулированная масса, равномерно заполняющая пространство, ограниченное оболочкой. Нормальная оболочка ооцитов коров имеет форму равномерного по ширине прозрачного ободка. К числу морфологических нарушений оболочки ооцитов следует отнести потерю прозрачности, деформацию, истончение или утолщение, надрыв ее или разрыв (рис. 5. 6; 4). 
После оценки жизнеспособности ооцит – кумулюсные комплексы помещают в модифицированную среду ТС – 199 (Sigma), содержащую 5% эстральной сыворотки коров, и ставят на культивирование в СО2 – инкубатор при температуре 38оС; 5% СО2 и 98% - ной влажности. Через 24 часа проводят оплодотворение. Капацитацию заморожено – оттаянной спермы осуществляют в модифицированном растворе Тироде (Sigma) с концентрацией гепарина 50 мкг/мл.

Совместное культивирование яйцеклеток и спермиев осуществляют в течение 18 часов.

После оплодотворения зиготы помещают в среду для культивирования ранних эмбрионов, представляющую собой модификацию среды ТС – 199 (Sigma), на монослой клеток кумулиса и инкубируют в течение 7-11 дней. Полученные эмбрионы пересаживают реципиентам. В 1999 году в лаборатории генетики РУП «НПЦ НАН Беларуси по животноводству» получены первые в республике телята из пробирки (in vitro).

     Криоконсервацию эмбрионов  используют (или планируют использовать) для поддержания и разведения  коллекций лабораторных и сельскохозяйственных животных, сохранения генофонда диких и исчезающих видов млекопитающих и решения репродуктивных проблем человека.

Главное преимущество банка эмбрионов перед банком половых клеток заключается в том, что эмбрион представляет собой особь, пусть и состоящую из небольшого количества клеток. После размораживания его достаточно пересадить самкам-реципиентам, чтобы родилось живое потомство.  Замораживать яйцеклетки технически сложнее, чем эмбрионы, сперматозоиды – проще, но в любом случае гораздо более хлопотным делом становится перевод законсервированных клеток в живую коллекцию, потому что после размораживания, необходимо еще произвести оплодотворение            

 Сейчас разработаны  надежные методы хранения эмбрионов, существует и оборудование для  криобанков. Практика показывает, что  правильно замороженные эмбрионы  могут храниться в жидком азоте  несколько десятилетий, не потеряв  жизнеспособности. Таким образом  можно, например, оптимизировать процесс  разведения сотен тысяч линий  лабораторных мышей и крыс.

Для хранения эмбрионов в криоархиве требуется несравненно меньше площади и средств, чем для поддержания той же линии в питомнике.           

 Метод криоконсервации  зародышей с успехом применяют  в отношении крупного рогатого  скота, овец и коз, идут работы  по сохранению исчезающего вида  овец – муфлона. Можно, хотя и  с бОльшими сложностями, криоконсервировать  эмбрионы свиньи; с лошадьми это  пока не получается.

Что касается хищников, то получить живое потомство после замораживания эмбрионов удалось пока только у домашней кошки, оцелота и хорька. (Создание криобанка хорьков – российско-финский проект).           

 Криоконсервацию успешно  используют и в репродуктивной  медицине, замораживая эмбрионы  человека.

 В некоторых случаях  на хранение закладывают ткани  генеративных органов – семенников  и яичников. Этот метод рекомендован  для восстановления плодовитости  у людей, перенесших в раннем  возрасте химио- и лучевую терапию. После окончания курса лечения  и полного выздоровления пациенту  пересаживают его же собственную  ткань, взятую из криобанка.           

 Не всегда эмбрионы  консервируют для длительного  хранения. Иногда нужна краткая  консервация, например, для пересылки  из одной страны в другую. Перевозить  замороженные эмбрионы гораздо  проще, чем животных.  Кроме того, в ходе криоконсерванции эмбрионы очищаются от вирусов, поэтому такую процедуру можно использовать для очистки линий лабораторных или сельскохозяйственных  животных  от инфекции. Размороженные и отмытые в стерильных средах эмбрионы пересаживают здоровым самкам и получают здоровое потомство.

Список литературы:

Сельскохозяйственная биотехнология: учеб. / В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.С. Воронин и др.; под ред. В.С. Шеве- лухи. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 2003. 469 с.

Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. М.: Дрофа, 2004. 256 с.

Биотехнология в животноводстве / В.Ф. Красота, Б.П. За- вертяев, Е.К. Меркурьева, А.К. Никитин. М.: Колос, 1994. 127 с.