Ветеринарная микробиология и иммунология

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. Возбудитель столбняка, систематика, морфология, патогенез. Лабораторная диагностика

 

Столбняк (ТЕТАNUS) - инфекция, возникающая после различных травм и ранений в связи с загрязнением ран почвой, содержащей столбнячной палочки (Clostridium tetani).

Морфология: возбудитель столбняка - это подвижная палочка 4-8 мкм в длину и 0,4-0,6 мкм в ширину с закругленными концами. Образует крупные споры, в результате этого приобретает вид барабанной палочки. Имеет жгутики, подвижны. Хорошо окрашивается всеми анилиновыми красками. По Граму красится положительно, но в старых культурах встречаются и грамотрицательные особи. Споры окрашиваются плохо. При окраске метиленовым синим или по Граму споры имеют вид колечек. Вегетативная форма бактерий столбняка мало устойчива к воздействию температуры и химических агентов, тогда как их споры обладают значительной устойчивостью. Во влажной среде споры выдерживают нагревание до 80 °С в течение 4 - 6 ч и более, при кипячении они погибают через 40-50 мин. В сухом состоянии споры переносят еще более высокие температуры, нагревание при 115 °С разрушает их только через 20 мин, споры совершенно не чувствительны к низким температурам. Они годами переносят температуру 40-60 °С, 1%-ный раствор сулемы или 5%-ный раствор карболовой кислоты убивает споры только через 10-12 ч. Под действием рассеянного света споры погибают только через длительное время. Будучи защищены от света в почве и на различных предметах внешней среды споры могут сохраняться в течение десятков лет. В условиях анаэробиоза при температуре 37 °С, достаточной влажности и в присутствии аэробных бактерий (стафилококки, сенная палочка и др.) споры прорастают в развивающиеся вегетативные формы.

 Эпизоотология. К столбняку наиболее восприимчивы собаки, лошади, крупный и мелкий рогатый скот, свиньи и другие животные.

Патогенез. Клостридии попадают в глубокие раны с омертвевшими тканями, начинают размножаться и выделять токсин, который действует на периферические нервы, распространяющиеся до центров в спинном и головном мозге. Это действие прояв-ляется специфической формой изменения тонуса, наблюдаемого у соответствующих мышечных групп.

Биология, культуральные свойства. Возбудитель столбняка - строгий анаэроб и очень чувствителен к кислороду. Микроб хорошо растет в глубине жидких питательных сред, при наличии в них глюкозы, кусочков печени или мышц (среда Китта-Тароцци). Для культивирования столбнячной палочки применяют бульон Мартена (мясо-пептонный с добавлением глюкозы, подщелоченной р-ром соды) среду Вейнберга (мясной агар).

Питательные среды должны иметь нейтральную или слабокислую реакцию. Жидкие среды заливаются слоем вазелинового масла и перед посевом из них удаляют кислород путем кипячения на водяной бане в течение 10-15 мин. Оптимальная температура роста 35-37 °С. На плотных питательных средах - кровяном и печеночном агаре - столбнячная палочка растет только при полном удалении кислорода. На чашках с агаром при температуре 35-37 °С через 2-4 суток вырастают отдельные прозрачные или слегка сероватые колонии величиной 2-5 мм с неровной зернистой поверхностью, края шероховатые, ветвящиеся. На кровяном агаре колония бывает окружена зоной гемолиза. При почве на скошенном агаре в пробирках микроб растет в виде тонких, едва заметных нитевидных отростков, выползающих на поверхность агара. В столбике желатина через 5-6 дней растет в виде елочки, желатина при этом не разжижая.

В биохимическом отношении  возбудитель столбняка малоактивен, обладает слабовыраженными сахаролитическими  и протеолитическими свойствами.

Антигенная структура - по антигенной структуре возбудитель столбняка неоднороден. Выделяют групповой соматический О-антиген и типоспецифический жгутиковый Н-антиген, по которому различают 10 серологических типов. Все они вырабатывают один и тот же специфический токсин.

Токсинообразование является важнейшей биологической особенностью вегетативной формы столбнячной палочки. Столбнячный токсин относится к экзотоксинам и состоит из двух фракций:

• тетаноспазмина со свойствами нейтротоксина, который поражает двигательные клетки центральной нервной системы и вызывает сокращение поперечно-полосатых мышц;
• тетаногемолизина, лизирующего эротроциты.

Экзотоксин является одним  из сильнейших бактериальных ядов, уступая по силе лишь ботулиническому  токсину. Токсин не содержит углеводов, относится к протеинам. Он малостоек, быстро разрушается под влиянием нагревания, солнечного света, щелочной среды. Ферменты и энзимы желудочно-кишечного тракта не разрушают токсин, но он не всасывается через слизистую оболочку кишечника, в связи с чем безопасен при попадании через рот. Под действием формалина и содержание в термостате при 37-38 °С в течение суток токсин утрачивает ядовитые, но сохраняет антигенные свойства. Полученный таким образом столбнячный анатоксин используют для активной иммунизации против столбняка.

Лабораторная диагностика  столбняка

 

Бактериологическое исследование - исследуется материал, взятый из раны: гной, кусочки тканей, инородные  тела, тампоны, закладываемые в рану при перевязке, перевязочный материал, содержащий выделения из раны, в случаях столбняка после родов или аборта берут на исследование выделения из влагалища и матки, при подозрении на столбняк у новорожденного исследованию подвергают выделения из пуповины, при исследовании трупа также берут материал из раны, если она имеется, из различных воспалительных очагов и старых рубцов.

В некоторых случаях столбняка  происходит генерализация инфекции, возбудитель может быть обнаружен  во внутренних органах. Поэтому берут  на исследование от трупа кровь, кусочки  печени и селезенки. Исследование материала  производится с целью обнаружения в нем столбнячного токсина и возбудителя столбняка.

Обнаружение столбнячного токсина: исследуемый  материал растирают в стерильной ступке, добавляют двойной объем  физиологического раствора. Часть материала  засевают в 2 флакона с жидкой питательной средой. Для постановки реакции нейтрализации на животных экстракт исследуемого материала вводят внутримышечно 2 мышам по 0,5 мл экстракта, а еще двум мышам те же дозы с противостолбнячной сывороткой. В зависимости от количества токсина симптомы столбняка у животных развиваются на первые или вторые сутки. У животных, получивших токсин с противостолбнячной сывороткой симптомы не появляются, что свидетельствует о наличии в исследуемом материале столбнячного токсина.

Одновременно с постановкой  реакции нейтрализации производят посев растертого материала в 2 флакона или 2 пробирки с питательной средой (бульон Мартена, бульон Вейнберга) под слоем вазелинового масла. Перед посевом из среды удаляют кислород путем кипячения 15 мин, а затем охлаждают до 40-50 °С и в нее добавляют 0,5 % глюкозы. После культивирования при температуре 35 °С на 2-е, 4-е, 6-е и 10-е сутки микроскопируют мазки из посевов и исследуют культуральную жидкость на наличие столбнячного токсина. Для этого ставят реакцию нейтрализации с противостолбнячной сывороткой. При обнаружении в посеве столбнячного токсина и наличии грамположительных палочек с крупными спорами дают положительный ответ.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5. Возбудитель дизентерии свиней, морфология, систематика, патогенез, лабораторная диагностика

 

Дизентерия свиней (Dysenteria suum) – инфекционная болезнь, характеризующаяся дифтерически-геморрагическим поносом и некротическим поражением толстого отдела кишечника. Восприимчивы свиньи всех пород и возрастов, но чаще болеет молодняк в возрасте 1-6 месяцев. Заражение происходит алиментарным путем.

 

Таксономической положение возбудителя

Семейство: Spirochaetaceae.

Род: Treponema.

Вид: T. hyodysenteriae.

 

Морфология

Treponema hyodysenteria – грамотрицательная спирохета. При микроскопии в темном поле трепонемы имеют форму подвижных нитей с ровными, правильно расположенными завитками и острыми концами. Размеры: (7-20)x(0,3-0,4) мкм. Морфологически различают три формы трепонем свиней: крупные – длиной до 20 мкм и 8-12 завитками, средние – 8-12 мкм с 6-8 завитками и малые – до 8 мкм с 3-4 завитками. Спор и капсул не образуют. Хорошо окрашиваются анилиновыми красителями.

 

Культуральные свойства

Возбудитель – анаэроб, оптимальная  температура 36-38° C (при 25 и 30° C не растет), pH 7,4-7,6.

Культивируется на специальных средах. К ним относятся:

• Плотные: трипсин-агар с 5 % цитратной крови крупного рогатого скота; соевый агар с 5 % крови крупного рогатого скота;
• Жидкие: триптический соевый бульон с 10 % сыворотки крови плода коровы и спектиномицина (400 мг/л); МПБ (pH 7,4-7,6) с кусочками мелко нарезанной печени коровы, 50 % асцитической жидкости и 1:5000 аскорбиновой кислоты.

Посевы культивируют в анаэробных условиях 4-8 дней. На дне чашки с  трипсин-агаром и 5 % крови через 72 часа развивается неправильной формы  размером 3-4 мм зона B-гемолиза, в центре которой на поверхности агара редко встречаются мелкие прозрачные колонии или нежная пленка со следами эрозии.

 

Биохимические свойства

Патогенные для свиней культуры не ферментируют фруктозу, утилизируют  пируват, при сбраживании глюкозы образуют водород, углекислоту, ацетат, бутират; нитрат не восстанавливают.

 

Факторы патогенности

Гемолитические свойства, могут продуцировать эндотоксины.

 

Патогенез

Попав в организм свиней алиментарным путем, Tr. hyodysenteria достигает толстого кишечника, где фиксируется на слизистой оболочке. Здесь часть бактерий погибает, из них освобождаются вазомоторные субстанции, сенсибилизирующие слизистую оболочку толстого кишечника и повышающие ее проницаемость. Это способствует проникновению возбудителя в подслизистую ткань. Размножение микробов идет одновременно с их разрушением и освобождением токсических продуктов, под действием которых происходят морфологические и физиологические нарушения функции кишечника, что приводит к развитию дисбактериоза. Некротические и воспалительные процессы часто усиливаются другими бактериями (F. necrophorum, Bacteroides fragilis и др.).

 

Устойчивость. Являясь строгим анаэробом, возбудитель вне организма имеет незначительную устойчивость. В фекальных массах при 0° C сохраняется до 48 дней, при 10° C – до 38, при 20° C – до 12 дней, в замороженном патматериале – не менее 2 месяцев. При возникновении анаэробных условий в навозной жиже возбудитель может не только длительно сохраняться, но и накапливаться.

Для дезинфекции применяют 4 %-ный (70^oС) раствор гидроокиси натрия и 2 %-ный раствор формальдегида. Возбудитель чувствителен к осарсолу, спирамицину и тилозину, а также мышьяковистым и нитроимидазольным препаратам.

 

 Лабораторная диагностика дизентерии свиней основана на эпизоотологических данных и результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя  в исходном материале методом  световой микроскопии (основной метод), а также выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим и ферментативным свойствам.

Материал для исследования. Для  прижизненной диагностики в лабораторию  направляют фекалии, для посмертной – слизистую оболочку большой  ободочной кишки, которую соскабливают после удаления из кишечника содержимого и промывания водой. От трупов материал берут не позднее чем через 2 ч после гибели животного, материал должен быть исследован в течение 2-4 ч, а при хранении на холоде – 6-8 ч. Из материала готовят суспензию.

Микроскопия препаратов из исходного  материала. Поскольку культивирование  возбудителя весьма трудоемко, микроскопическое исследование – это основной метод  диагностики, доступный практическим лабораториям. Поступивший материал исследуют методом темнопольной, фазово-контрастной или обычной световой микроскопии.

При темнопольной микроскопии препарат «раздавленная капля» исследуют  в водной иммерсии с объективом x40 и окулярами x7 или x10. Возбудитель в этом случае виден как спиралевидная клетка с 3-12 правильными витками размером (7-9)x(0,3-0,4) мкм, движущаяся змеевидно-поступательно. При температуре 22° C наблюдают изгибание и скользящее движение клетки, а при 37-42° C клетка движется поступательно. У большинства больных дизентерией свиней в препарате «раздавленная капля» в одном поле зрения обнаруживают 5-10 спирохет и более.

В окрашенных по Граму препаратах видны грамотрицательные извитые  клетки со строением, типичным для спирохет. Клетки возбудителя хорошо окрашиваются по Романовскому-Гимзе, фуксином Пфейффера. Разработан также прямой вариант реакции иммунофлюоресценции.

Выделение и идентификация  культуры возбудителя. Для первичной изоляции используют селективные среды, например следующие.

Кровяной агар со спектомицином: к  перевару Хоттингера добавляют 0,001 % резазурина (индикатор ОКВП), 0,5 % хлорида натрия, 0,25 % глюкозы, 1 % пептона, 2 % агара, кипятят, пропускают через среду азот или оксид углерода (IV) в течение 10-15 минут, устанавливают pH 7,0-7,2, вносят 0,05 % гидрохлорида цистеина. Среду автоклавируют при 110° C 30 минут, охлаждают до 40-45° C, пропуская при этом через среду стерильный обескислороженный газ, после чего вносят 10 % дефибринированной крови барана (или крупного рогатого скота) и 400 мкг/мл спектомицина. Среду разливают в атмосфере оксида углерода (IV).

Культивируют также в жидкой или полужидкой среде, содержащей сердечно-мозговую вытяжку и 10% эмбриональной телячьей или кроличьей сыворотки. На кровяном агаре через 48-96 ч инкубирования  при 38° C вырастают плоские просвечивающие колонии диаметром 0,5-3 мм с зоной бета-гемолиза. В полужидком сывороточном агаре возбудитель растет в виде беловатого диффузного облачка ближе к поверхности среды.