Правила работы в вирусологической лаборатории

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 29 Мая 2013 в 16:53, лабораторная работа

Описание работы

Цель занятия: ознакомиться с планировкой и оборудованием вирусологической лаборатории, ее документацией, правилами и техникой безопасности при работе с вирусодержащим материалом.

Файлы: 1 файл

практикум по вирусам.doc

— 8.87 Мб (Скачать файл)

Керамические свечи представляют собой удлиненной формы полые цилиндры, закрытые в нижней части (свечи Шамберлена, Беркефельда, каолиновые фильтры Санкт-Петербургского керамического НИИ). Их изготовляют из каолина с различной степенью порозности.

Стеклянные фильтры готовят из пористого стекла. В последние годы довольно широкое распространение получили фильтры Шота с пластинкой №5 из сплавленных мельчайших гранул отекла.

Суспензии, содержащие вирус, перед фильтрованием необходимо освободить от грубой взвеси. Для этого их вначале центрифугируют в течение 10...15 мин при 1500...2000 об/мин и фильтруют через бумажный фильтр большой порозности (800 нм). Суспензия, подлежащая стерилизующему (заключительному) фильтрованию, должна быть прозрачной и лишь слегка опалесци-рующей. Жидкость, хранившуюся на холоде, перед фильтрованием рекомендуется в течение часа выдержать при комнатной температуре, а затем нужный ее объем вылить в стакан фильтровального прибора. В приемном сосуде (колбе) создают разрежение при помощи водоструйного или масляного насоса (рис.5). Фильтрат проверяют на стерильность (наличие бактерий, грибов) путем посева на МПА, МПБ, среду Сабуро.

Следует отметить, что фильтрование сопровождается адсорбцией вируса на фильтре и приводит к его значительным потерям.

Отбор крови для серологических исследований. Для серологической диагностики необходимо иметь две пробы сыворотки крови (парные сыворотки), взятые в начале и в конце болезни. Первую пробу берут как можно раньше — в инкубационный период или в начале проявления клинических симптомов болезни, вторую — во время выздоровления или через 2...3 недели после заболевания. Брать кровь и готовить сыворотку необходимо стерильно, нельзя применять энтикоагулянты или консерванты, которые могут придать сыворотке антикомплементарность, а в реакции нейтрализации оказать инактивирующее действие на вирус, оказаться токсичными для культур клеток или просто нестерильными. Кровь в объеме 10... 15 мл берут в стерильные пробирки с резиновыми пробками, выдерживают при комнатной температуре до образования сгустка, обводят стеклянной палочкой или

а б в

Рис.5. Приемы стерилизующего фильтрования: а — фильтрование через свечу Беркефельда — снаружи внутрь с водоструйным насосом; б — схема присоединения к вакуум-насосу с тройником и зажимом Гофмана для выравнивания возможных перепадов давления: 1 — воронка Уленгута; 2 — приемник; 3 — ватный фильтр; 4 — колба Бунзена; 5 — тройник со свободным концом трубки и зажимом; 6 — водоструйный насос; в — стерилизующее фильтрование через свечу Шамберлена — изнутри наружу

другим инструментом и переносят в холодильник при 4 °С на 18...20 ч. После максимальной ретракции сгустка сыворотку отсасывают, добавляют пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл, проводят высевы на бактериологические среды. Вместо отстаивания в холодильнике можно после обведения кровь центрифугировать.

Серологические методы вирусологической диагностики требуют исследования парных проб сывороток, поэтому необходимо правильно сохранять первые пробы, пока не будут получены вторые. Хранить сыворотки необходимо в холодильнике при 4 °С или в замороженном виде, строго соблюдая порядок нумерации проб и соответствия записей в журнале и на пробах.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Подготовить исследуемый материал для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и культур клеток путем обработки антибиотиками.

2. Проверить полученный материал на стерильность путем высева на МПА, МПБ.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольные вопросы.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация:    а) набора   посуды   и   инструментов;

б) приемов взятия смывов со слизистой оболочки носовой полости, конъюнктивы, прямой кишки у телят и других животных;

в) этикетирования и транспортировки взятого материала.

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания Занятие можно провести следующим образом. Первый час посвятить объяснению и демонстрации приемов взятия материала от животных, находящихся в клинике института. Второй час студенты проводят работу по подготовке материала к исследованию.

На данном занятии ограничиваются только демонстрацией взятия материала от животных, так как весь процесс студенты будут отрабатывать при прохождении учебно-производственной практики.

Вопросы домашнего задания

1. Морфология и химический состав вирусов.

2. Структура вирусов.

3. Функции нуклеиновой кислоты и вирусного белка в онтогенезе вирусов.

4. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

5. Вирусоскопический метод исследования с использованием светового микроскопа.

ЗАНЯТИЕ 3. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Вирусоскопический метод исследования

Цель занятия: ознакомиться с методами лабораторной диагностики, световой микроскопии, а также техникой приготовления и способами окрашивания мазков, препаратов-отпечатков и гистосрезов для выявления вирионов и внутриклеточных включений.

Оборудование и материалы: микроскопы (соответственно количеству студентов), демонстрационные препараты с вирусами оспы, включениями Бабеша-Негри; предметные стекла, вируссо-держащий материал (например, вирус осповакцины), пастеровские пипетки, реактивы для окрашивания по методу Морозова, таблицы по теме, диапозитивы.

Краткие теоретические сведения

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций следующие.

1. Вирусоскопический метод исследования: а) в световом микроскопе; б) в люминесцентном микроскопе; в) в электронном микроскопе.

2. Выделение и культивирование вирусов путем заражения развивающихся куриных эмбрионов, лабораторных животных и культур клеток.

3. Серологический метод исследования (идентификация вирусов) — постановка серологических реакций (РЗГА, РН и др.).

4. Биологический метод.

\JМикроскопию в световом микроскопе проводят с целью выявления крупных вирусов-вирионов, внутриклеточных включений и изучения патологических изменений клеток, пораженных вирусами (ЦПД). Вирион — это зрелый внеклеточный вирус. Включения представляют собой вирусный материал, находящийся внутри клетки, в образовании которого участвуют и клеточные продукты. Вирионы могут быть обнаружены в мазках и препаратах-отпечатках из инфицированной ткани; включения — только в препаратах-отпечатках и гистосрезах, приготовленных из пораженных органов и тканей.

Оспа овец, свиней и коров, эктима овец, оспа-дифтерит птиц — это такие инфекции, при которых обнаружение вирионов-возбудителей приобрело диагностическое значение. Для выявления вирионов используют методы окрашивания, которые позволяют увеличить вирусную частицу в размерах и сделать ее более контрастной. В целях получения хороших результатов используют чистые обезжиренные предметные стекла. Препараты готовят из тщательно размельченного материала или путем отпечатков, стараясь сделать их как можно тоньше. При каждом вирусном заболевании учитывают, какие органы и ткани наиболее поражены и какие участки их следует исследовать, выбирают также соответствующий метод фиксации. Существует ряд методов окраски вирионов.

Окраска по Морозову применяется в процессе диагностики оспы, эктимы овец и орнитоза. Возбудителей болезни выявляют в препаратах-отпечатках, мазках из чистых суспензий. При исследовании последних на предметное стекло пастеровской пипеткой наносят небольшую каплю материала и распределяют ее тонким слоем, для окрашивания готовят три реактива.

Реактив №1 (фиксатор — жидкость Руге): 2 мл 40%-ного формальдегида (продажный формалин), 1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл дистиллированной воды.

Реактив №2 (протравитель): 5 г танина, 2 мл жидкого фенола, 100 мл дистиллированной воды (если появляется осадок, раствор фильтруют).

Реактив №3 (краситель): 5 г азотнокислого серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, затем осторожно по каплям добавляют раствор 25%-ного аммиака до появления легкой опалесценции. Перед употреблением разводят дистиллированной водой 1:10.

Готовые препараты высушивают на воздухе, 2...3 мин отмывают дистиллированной водой в вертикальном положении. Затем на них наносят реактив №1, через 1 мин его сливают, мазок промывают и наносят на 1...2 мин реактив №2, проводя препарат над пламенем спиртовки до появления паров. Далее мазок тщательно промывают дистиллированной водой и на 1...2 мин наносят реактив №3, прогревая препарат на огне, пока он не станет темно-коричневым. После этого препарат снова тщательно промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.

На светло-коричневом фоне препарата вирионы имеют вид темно-коричневых или черных точек, расположенных одиночно, попарно или в виде скоплений (рис.6,7). Результат будет положительным только в случае массового обнаружения характерных образований.

Окраска по Маккиавелло сводится к следующему. Высушенные нефиксированные препараты окрашивают 5 мин профильтрованным 0,25% -ным раствором основного фуксина, краситель сливают, а мазок быстро (1 с) проводят через 0,5%-ный раствор лимонной кислоты, тщательно промывают водопроводной водой и окрашивают 5-10 с 1%-ным раствором метиленовой сини. Затем препарат вновь промывают, высушивают и микроскопируют. Вирионы окрашиваются в яркий рубиново-красный цвет, цитоплазма клеток — в светло-синий, ядра — в темно-синий (рис.8).

Окраска по Романовскому-Гимзе заключается в том, что

* ■ .^шт».  -.

» > да* '

С. f '

Рис.8. Скопление элементарных

телец в мазке-отпечатке зараженной белой мыши (через 48 ч). Окраска по Маккиавелло

Рис.9. Скопление элементарных телец в мазке-отпечатке мозга зараженной белой мыши (через 48 ч). Окраска по Романовскому-Гимзе

препараты фиксируют в метиловом спирте 5 мин, наносят на них раствор краски Рома-новского-Гимзы (1 мл маточного раствора на 10... 15 мл дистиллированной воды), окрашивают 30...60 мин, краску сливают и тщательно промывают дистиллированной водой в течение 10... 15 мин. Высушенные препараты лучше провести через абсолютный спирт, толуол и заключить в бальзам.

Вирионы при этом способе окрашивания приобретают темно-фиолетовый цвет, фон препарата — голубой (рис.9).

При некоторых вирусных инфекциях диагностическим признаком является образование в клетках особых включений. Они обнаруживаются при бешенстве, оспе, гриппе свиней, чуме собак, болезни Ауески и др. Специальными методами окраски выявляются как внутрицитоплазматические, тик и внутриядерные включения. Наиболее часто они используются при Диагностике бешенства.

Окраска по Муромцеву. Препарат фиксируют метиловым спиртом, отмывают от фиксатора и окрашивают 10 мин синькой Ман-сона (в 100 мл кипящей дистиллированной веды растворяют 5-6 г химически чистой буры, добавляют 2 г метиленовой сини, охлаждают и фильтруют) в разведении 1:40. Непромытый мазок выдерживают в 10% -ном растворе танина до тех пор, пока он не

Рис.10. Внутриклеточные включения Бабеша-Негри. Окраска по Муромцеву

приобретет вместо сине-

фиолетового цвета голубой. Затем его промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и в течение нескольких секунд проводят через абсолютный спирт. После этого высушивают и микроскопи-руют. Включения Бабеша-Негри представляют собой фиолетовые образования различных размеров (0,2...20 мкм) и формы на голубом фоне цитоплазмы, ядра клеток окрашиваются в синий цвет (рис.10).

Окраска по Манну. Препарат фиксируют в жидкости Буэна 2 ч и окрашивают 4 ч при 37 °С или 18 ч при комнатной температуре в растворе следующего состава: 17 мл 1%-ного раствора метиленовой сини, 23 мл 1%-ного раствора эозина, 40 мл дистиллированной воды. Раствор готовят перед употреблением. После окрашивания препарат тщательно промывают и обезвоживают в трех растворах щелочного спирта: 1) к 30 мл абсолютного спирта добавляют 30 капель 1%-ного раствора каустической соды в этом спирте, 2) к 30 мл абсолютного спирта добавляют 20 капель раствора соды, 3) к 30 мл абсолютного спирта добавляют 10 капель раствора соды. Обезвоживание прекращают, если препарат принимает светло-розовый оттенок. Такой препарат проводят через абсолютный спирт и обезвоживают в кислом спирте (30 мл абсолютного спирта и 1 капля ледяной уксусной кислоты). На фоне голубых клеток видны Рис.11. Срез мозга собаки, павшей ярко-красные включения, синие от бешенства. Тельца Бабеша- ядра и ядрышки клеток Негри. Окраска по Манну (рис.11).

Окраска по Туревичу. Препарат фиксируют в метиловом спирте. Для проведения окраски необходимо иметь следующие реактивы: железный гематоксилин Вейгерта, 1%-ный водный раствор кислого фуксина, насыщенный раствор пикриновой кислоты, разведенный пополам 96° спиртом. Для получения железного гематоксилина Вейгерта готовят два состава: 1) 1%-ный раствор гематоксилина в 96° спирте. Раствор должен созревать в течение 2...3 недель; 2) 1,16 г хлористого железа, 98 мл дистиллированной воды и 1 мл концентрированной соляной кислоты. Перед употреблением смешивают равные количества обоих растворов. Как только смесь приобретает фиолетовый оттенок, ее наносят

Рис.12. Внутриклеточные включения Бабеша-Негри (окраска по Туревичу):

1 — включения;

2 — эритроциты;

3 — цитоплазма

на препарат и окрашивают 1...2 мин, промывают дистиллированной водой. Затем окрашивают 1%-ным водным раствором кислого фуксина в течение 1 мин и тщательно промывают дистиллированной водой до появления бледно-розового оттенка. После промывки дифференцируют раствором пикриновой кислоты в течение 10...20 с до появления желтого оттенка. Препарат быстро прополаскивают в дистиллированной воде и слегка обсушивают фильтровальной бумагой, проводят через абсолютный спирт или ксилол и заключают в бальзам. Тельца Габеша-Негри — вишнево-красного цвета, ядра клеток — черные на серо-желтом фоне цитоплазмы (рис.12). Кроме указанных методов, для выявления включений можно использовать окрашивание по Романовскому-Гимзе. Включения при этом приобретают темно-фиолетовый цвет, цитоплазма — голубой.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Приготовить препараты-отпечатки из вируссодержащего материала и окрасить их по Морозову.

Информация о работе Правила работы в вирусологической лаборатории