Электронная микроскопия

Широкое распространение получила методика негативного контрастирования вирусов с помощью вольфрамофосфорной кислоты (Н3РW12О40), которая при подщелачивании едким калием или едким натрием (от значения рН 2,0 до рН 7,0) изменяется и после нанесения препарата на вирус создает зону высокого рассеивания электронов, в результате чего выявляются морфологические признаки вируса.

Развитию знаний о структуре вириона способствовали криогенные методики. Один из простейших вариантов таких методик заключается в следующем: сетки с подложкой и находящимися на них вирусами после нанесения контрастирующего раствора помещают в сжиженный пропан (температура -150˚) или переохлажденный азот (температура -200˚). Дальнейшее высушивание образца при температуре -100˚ в глубоком вакууме способствует сохранению трехмерной организации вириона. Исключение в этих условиях деформирующей роли сил поверхностного натяжения воды привело к пересмотру точки зрения, что форма вириона у липидосодержащих вирусов обладает высокой лабильностью. Более сложные криогенные методики, применяемые в электронной микроскопии (например, криоскалывание), также внесли заметный вклад в развитие представлений о структуре вирионов, особенно об имеющих липопротеидную оболочку.

Структура генома вирусов изучается с помощью модифицированной в 1959 году Клейштейном и Лангом методики оттенения линейных макромолекул тяжелыми металлами, которые испаряются с В-образным катодов под углом в 5-10˚.

Условием, позволяющим изучить нуклеиновые кислоты, и особенно однонические (поперечный размер 1-1,1 нм), является связывание их с основными белками, т.к. при этом образующийся нуклеопротеид имеет диаметр до 18 нм в двунитчатых структурах и до 15 нм – в однонитчатых. В качестве такого белка чаще используют цитохром С. Помещенная на подложку нуклеиновая кислота в белковом чехле имеет самый причудливый контур, и возможность увидеть ее на всем протяжении осуществима только в том случае, если во время оттенения металлами будет совершен хотя бы один поворот сетки с объектом для напыления на 360˚. Лучшие результаты достигаются при длительном оттенении (до 10 минут) сплавом платины с палладием и многократном поворачивании напыленной сетки на вращающемся столике.

Многочисленные модификации методики Клейшмидта и Ланга позволяют получать данные не только о длине генома, но изучать и степень гомологии генома различных вирусов, локализовать вставку того или иного гена  в состав гибридных молекул, исследовать гибридные молекулы нуклеиновых кислот.

Общая информация о морфогенезе вирусов получена с помощью ультратонких срезов вирусов. Техника получения ультратонких срезов вирусов не отличается от общепринятой.

В последние годы возрастает удельный вес ЭМ как экспресс-метода или диагностики вирусных инфекций. Особенно велика роль метода иммунной микроскопии, позволяющего установить родовую принадлежность вируса.

Иммунная ЭМ сыграла решающую роль на первых этапах исследования инфекционного гепатита (гепатита А), а также вирусных гастроэнтеритов и внесла существенный вклад в изучение гепатита В.

Теоретические основы иммуноморфологии на светооптическом уровне разработаны в 1942 году Кунсом с сотрудниками, которые впервые показали, что в молекулу антитела можно ввести некоторые вещества, не нарушая существенно их специфичности. Развитие этой идеи позволило в 1959 году Зингеру разработать иммунноморфологический  метод на электронномикроскопическом уровне, основанный на использование антител, меченных ферритином. Ферритин-белок с высоким содержанием железа, в котором атомы металла организованны в 4 субъединицы, расположены близко друг к другу, что обеспечивает высокое рассеивание электронов при ЭМ и четкое выявление молекулы.

Конъюгация белка с антителом возможна с помощью различных бифункциональных агентов, наибольшее распространение среди которых получили 3,4-толуендиизоцианат и ксиленметадиизоцеанат. Иммунная электронная микроскопия с помощью антител, меченных ферритином, эффективна для выявления экстрацеллярных антигенов микробов в инфицированных тканях, в том числе вирусных антигенов на поверхности клетки, а также поверхностных антигенов в клетке. Вместе с тем эта методика в ряде случаев неэффективна, например, если необходимо исследовать внутриклеточные объекты, антигены микробов внутри клетки, что имеет место, в первую очередь, при вирусных инфекциях. Это обусловлено тем, что молекулярный вес (масса) антител, меченных ферритином, около 800 тыс., и поэтому проихождение их через плазматическую мембрану клетки невозможно, а антитела, меченные ферритином, проникшие через нее путем эндоцитоза не вступают в контакт со специфическим антигеном. Поэтому основная масса исследований, связанная с выявлением внутриклеточных антигенов с помощью антител, меченных ферритином, выполнена при разрушении плазматической мембраны путей замораживания-оттаивания или обработки комплиментом. Замена ферритина низкомолекулярными соединениями, содержащими ртуть, йод, не нашла широкого применения из-за низкой специфичности метода.

С конца 60-ых годов 20-го века в иммунологии применяется иммуннопероксидазная методика ЭМ для обнаружения антигенов внутри и на поверхности клеток. Перексидаза, используемая для метки антител, позволяет получить наилучший эффект по сравнению с другими ферментами (фосфотазы, некоторые оксидазы) благодаря более низкому молекулярному весу (около 40 тыс) и устойчивости к различным гистологическим процедурам. Антитела, меченные пероксидазой, проникают в клетку и связываются с гомологичным антигеном. Конъюгирование антител с ферментом осуществляется рядом бифункциональных агентов, среди которых наиболее доступным является глутаровый альдегид. После того как произошла связь антитела с соответствующим антигеном, локализация фермента выявляется после контакта его с соответствующим субстратом – бензидином, а-нафтолом, смесью а-нафтола, с р-ферментом. В присутствии перекиси водорода образуется продукт с более выраженной рассеивающей способностью электронов по сравнению с окружающими структурами. 

                  СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Б. Хабаров, Г.Куликов, А.Парамонов. Техническая  диагностика и ремонт бытовой радиоэлектронной аппаратуры. – Мн.: Издательство: Горячая Линия – Телеком, 2004. – 376 с.

2. Дэвидсон Г. Поиск неисправностей  и ремонт электронной аппаратуры  без схем. 2-е издание. М. Издательство: ДМК Пресс. 2005, - 544 с.