Анализ эфирного масла физико-химическими методами

 

Ниже сопоставлены две хроматограммы, полученные в результате анализа натурального (вверху) и фальсифицированного эфирного масла дистиллированного лимона.

В натуральном масле число компонентов значительно больше, содержание лимонена (пик 10.11) составляет 63%. Присутствуют сложные эфиры – нерилацетат и геранилацетат (пики 24.36 и 25.17). В области сесквитерпеновых углеводородов в натуральном эфирном масле присутствуют характерные для лимона компоненты: β-кариофиллен (пик 26.50), транс-α-бергамотен (пик 27.23) и β-бисаболен (пик 30.20).

Фальсифицированное масло содержит 93% лимонена (пик 10.13). Это значительно выше показателя, характерного для натурального лимонного масла (58-72%). Обычно для создания такого лимонного масла используют детерпенизированное лимонное масло с небольшой добавкой синтетического или природного цитраля (пики 18.98 и 20.30). Практически отсутствуют сесквитерпены и сложные эфиры – нерилацетат и геранилацетат, характерные для натурального масла. Добавлены нехарактерные для натурального лимонного масла линалоол и линалилацетат (пики 12.86 и 19.68).

 

Хроматограмма натурального (вверху) и фальсифицированного (внизу) эфирного масла лимона.

 

 

 

 

При установлении подлинности эфирного масла необходим здравый смысл и интуиция, а также длительный опыт работы в области хроматографирования эфирных масел различных типов, сортов и происхождения. Это позволяет различать эфирные масла при рассмотрении хроматограммы так же легко, как мы узнаем знакомого человека по его внешнему виду.  

 

Основная проблема хроматографии – идентификация отдельных пиков, то есть расшифровка состава эфирного масла на основании данных, полученных в результате хроматографирования. Обычная хроматография с пламенным детектором имеет ограниченные возможности идентификации и ее используют для анализа эфирных масел, для которых качественный состав и последовательность выхода компонентов известна. Для экспертной работы, которая связана с выявлением неизвестных примесей в эфирных маслах, необходимо применять масс-спектрометрический детектор. Это делает возможным проводить идентификацию компонентов эфирного масла автоматически, в ходе выполнения аналитического цикла. Такие хроматографы, сочетающие обычный хроматограф (GC) и масс-спектрометрический детектор (MSD) получили название хромато-масс-спектрометра (ХМС, GCMS – gas-chromatography-mass-spectrometry). Обычная стоимость хроматографа с пламенным детектором - 10,000-50,000$ (чаще всего цена зависит от производителя), стоимость хромато-масс-спектрометра 110,000-200,000$.

При идентификации компонентов методом MS выходящие из колонки вещества не попадают в горящее пламя водорода, а направляются в вакуумную камеру, где попадает в поток электронов, имеющих стандартную энергию (70 эв). Эти электроны разбивают молекулу вещества на заряженные осколки (ионы), состав, заряд и количество которых в стандартных условиях для каждого вещества является постоянным. Графическое изображение каждого вещества после электронного удара в виде набора его фрагментов в координатах «молекулярная масса иона - количество ионов» называется масс-спектром. Информация о веществах, их структуре и соответствующих им масс-спектрах хранится в виде баз данных в компьютерах, обслуживающих работу GCMS. В процессе хроматографического разделения по мере выхода веществ из колонки происходит непрерывная их бомбардировка электронами, получение масс-спектра, сравнение его с базой данных и выдача результатов. Наибольшая по объему библиотека масс-спектров находится в базе данных NIST05 (175000 структур) и Wiley (около 300000 веществ).

 

 

 

 

 

 

Масс-хроматограмма эфирного масла, декларированного как нероли.

 

 

 

    1   6.927     0.399% α-пинен 

2   8.259     0.239% сабинен 

3   8.361     1.275% β-пинен 

4   8.901     0.537% мирцен 

5  10.184     0.249% пара-цимен 

6  10.356     7.669% лимонен 

7  11.149     0.304% оцимен 

8  11.564     0.850% γ-терпинен 

9  13.591    30.701% линалоол 

11  15.392     0.620% цис-β-терпинеол 

12  16.250     0.233% транс-β-терпинеол 

13  17.476     4.988% α-терпинеол 

14  17.742     1.464% γ-терпинеол 

16  20.361    26.146% линалилацетат 

19  22.025     0.223% индол 

20  23.959     0.892% метилантранилат 

21  25.782     0.657% геранилацетат 

22  31.897     3.279% цис-неролидол 

23  33.083     4.840% транс-неролидол 

24  40.388     2.886% бензилбензоат 

25  43.968     9.213% бензилсалицилат  

 

Результаты GCMS представляют собой ряд предложений по идентификации в виде альтернативных формул веществ и степень сходства их масс-спектра с масс-спектром, полученным в ходе хроматографического разделения. Задача исследователя – отобрать из них наиболее приемлемый вариант. На рисунке показан масс-спектр неизвестного вещества с временем выхода 33.08 мин. Ниже показан рисунок масс-спектра вещества, наиболее близкого по масс-спектру с неизвестным веществом. Степень сходства составляет 92%. Таким образом, для неизвестного вещества с временем выхода 33.08 мин принят транс-3,7,11-триметил-1,6,10-додекатриен-3-ол, который имеет тривиальное название транс-неролидол.  

 

Масс-спектр одного из компонентов с временем выхода 33.08 мин на хроматограмме эфирного масла нероли.

 

 

Масс-спектр и формула вещества, предложенного для компонента с временем выхода 33.08 мин.

 

 

При установлении химического состава методом хромато-масс-спектрометрии пользуются законами биогенетической взаимосвязи компонентов в эфирных маслах. Например, если в эфирном масле идентифицирован линалилацетат и не найден линалоол, то это не является правильным выбором. Аналогично, если идентифицирован нерол, а отсутствует гераниол (эти два вещества всегда присутствуют вместе), то  такая идентификация сомнительна. Часто тимол сопровождает карвакрол, пара-цимен и γ-терпинен, пинокамфон – изопинокамфон, ментон - изоментон. Взаимосвязи компонентов в эфирных маслах обусловлены существующими в растениях достаточно однообразными биохимическими процессами, которые связывают все компоненты эфирных масел в единый биологический цикл. Знание таких процессов позволяет избежать ошибок при идентификации.   

 

После идентификации всех компонентов данные анализируют и сопоставляют с данными, полученными для образца натурального нероли. При этом сразу можно обратить внимание, что в составе исследованного эфирного масла нероли находятся компоненты, которые в натуральных эфирных маслах встречаются очень редко и в небольшом количестве – это β-терпинеол (цис- и транс-изомеры) и γ-терпинеол. Эти терпинеолы обычно сопутствуют синтетическому α-терпинеолу. Они также содержатся в эфирных маслах, которые подвергли редистилляции. Кроме того, неролидол в нашем образце содержится в виде двух изомеров (цис- и транс-неролидола) в то время как в природных продуктах содержится только транс-изомер. Среди посторонних для нероли примесей можно обнаружить также бензилбензоат и бензилсалицилат, но при этом отсутствует типичный для нероли фарнезол. При наличии геранилацетата отсутствует нерилацетат (они всегда в природных продуктах сопутствуют друг другу). Уже эти данные указывают на искусственное происхождение проанализированного образца эфирного масла. Известно, что в лучшем случае для приготовления искусственного нероли используют эфирное масло петигрейн-парагвай. В данном случае мы имеем типичный случай подобной фальсификации. Такую искусственную смесь синтетических добавок (терпинеолы, бензилбензоат, бензилсалицилат, индол, метилантранилат, линалилацетат) и натурального петигрейн-парагвай очень часто предлагают как хороший заменитель натурального нероли. 

 

Хроматограмма натурального стандартного эфирного масла нероли (Тунис)  

 

 

1. a-пинен 1% 

2. сабинен 1% 

3. b-пинен 6-10% 

4. мирцен 2% 

5. a-терпинен 0.1% 

6. лимонен 10-15%  

7. Цис-b-оцимен 1%    

8. транс-b-оцимен 7% 

9. γ-терпинен 0.2%

10. терпинолен 0.4%

11. линалоол 30-45%

12. терпинен-4-ол 0.5%

13 a-терпинеол 2-4%

14. нерол 1-2%

15. гераниол 2-3%

16. линалилацетат 2-12%

17. метилантранилат 0.1-0.3%

18. нерилацетат 2%

19. геранилацетат 4%  

20. b-кариофиллен 0.5%

21. b-фарнезен 0.2%

22. гермакрен D 0.2%

23. бициклогермакрен 0.3%

24. неролидол 1-2%

25. фарнезол 1-2%

 

Частая ошибка идентификации - ложные пики, образующие как артефакты при анализе эфирных масел (остатки от предыдущей пробы, примеси в растворителях, продукты разложения жидкой фазы в колонках). Такие "находки" следует ждать всегда. По крайней мере, надо хорошо представлять возможный химический состав хроматографируемого объекта и упредить появление возможных "фантомов".

Кроме того, каждый компонент, идентифицированный с помощью хромато-масс-спектрометра, должен быть сверен со своим индексом удерживания и лишь на основании такой всесторонней оценки делается вывод об окончательной идентификации. 

Иногда для получения вспомогательной информации (для уточнения идентификации) проводят хромато-ольфактометрию профиля компонентов эфирных масел. Для этого в процессе хроматографического анализа выходной конец хроматографической колонки обнюхивают. Выходящие последовательно компоненты эфирного масла оцениваются экспертами качественно. Наиболее интересные вещества идентифицируются для возможности дальнейшего их синтеза и использования для создания парфюмерных композиций. Этим методом, удается четко и наглядно представить себе вклад отдельных составляющих эфирного масла в его аромат. Так было установлено, что в состав эфирного масла розы входят на уровне миллионных долей органические сульфиды, гнилостный запах которых иногда удается почувствовать в некоторых образцах эфирного масла розы. Не следует думать, что "плохой" запах - это плохо. Среди компонентов эфирных масел многих цветочных растений (жасмин, например) содержатся производные индола, имеющие в чистом виде запах человеческих экскрементов. Но при содержании на уровне 0.01% они имеют запах очень похожий на запах жасмина.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы:

 

1. Государственная Фармакопея СССР XI изд. В 2-х выпусках  – М.: Медицина, 1990. – Выпуск 2 – 400 с.
2. Баева, В.М. Методическое пособие к практическим занятиям по теме: «Лекарственное растительное сырье, содержащее полисахариды» / Под ред. И.Н. Самылиной - Москва: Изд-во ООО Издательский дом «Русский врач», 1999. - 75 с.
3. Биохимические методы анализа растений / Под ред. М.Н. Запрометова. - М.: Инлитиздат, 1960. - 384 с.
4. Биохимия растений / Под ред. В.Л. Кретовича. - М.: Мир, 1968. - 668 с.
5. Государственный реестр лекарственных средств, разрешенных для применения в медицинской практике и к промышленному производству. М., 1998.
6. Долгова, А.А. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии / Долгова А.А., Ладыгина Е.Я. – М.: Медицина, 1977. – 256 с.
7. Ермакова, А.И. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермакова. –Л., 1972. - 364 с.
8. Жданов, Ю.А. Практикум по химии углеводов / Жданов Ю.А., Дорофеенко Г.Н. - Росвузиздат, 1963. - 169 с.
9. Количественное определение иридоидов / Л.В. Федосеева, Д.М. Попова // Фармация. - 1997. - № 4. - С. 18-21.
10. Кретович, В.Л. Биохимия растений / В.Л. Кретович. - М.: Высшая школа, 1985. - 503 с.
11. Кузнецова, Г.А. Природные кумарины и фурокумарины / Г.А Кузнецова - Л.: Наука, 1975. - 295 с.
12. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия: Учебное пособие / Под ред. Г.П. Яковлева, К.Ф. Блиновой. - СПб.: СпецЛит, 2004. - 765 с.
13. Лекарственные растения государственной фармакопеи / Под ред. И.А. Самылиной, В.А. Северцева. – М.: "АНМИ", 1999. – 488 с.
14. Лекарственные растения государственной фармакопеи / Под ред. И.А. Самылиной, В.А. Северцева. – М.: "АНМИ", 2003. – 534 с.
15. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. - 14-е изд. перераб. и доп. / М.Д. Машковский – М.: Новая волна, 2000. – 2 т.
16. Методы химии углеводов / Под ред. В.П. Кочеткова - М.: наука, 1967. - 482 с.
17. Муравьева, Д.А. Фармакогнозия: Учебник. – 4-е изд., перераб. и доп. / Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. – М.: Медицина, 2002. – 656 с.
18. Правила сбора и сушки лекарственных растений (сборник инструкций) / Под. ред. А.И. Шретера. – М.: Медицина, 1985. – 328 с.
19. Растения для нас: Справочное издание / Блинова К.Ф., Вандышев В.В., Комарова М.Н. и др. // Под ред. Г.П. Яковлева и К.Ф. Блиновой – СПб.: Изд-во «Учебная книга», 1996. – 654 с.
20. Тюкавкина, Н.А. Биоорганическая химия / Тюкавкина Н.А., Бауков Ю.И. - М.: Медицина, 1985. - 480 с.
21. Тютюнников, Б.Н. Химия жиров / Б.Н. Тютюнников - М.: Пищепромиздат, 1974. - 448 с.
22. Фармакогнозия. Атлас / Под. ред. Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронич. – М.: Медицина, 1983. – 512 с.
23. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронич. - М.: Высшая школа, 1983. - 176 с.