Области практического применения генной инженерии

температуры (немногим  ниже  температуры  кипения  воды)  и  разные  условия

влажности.  Поэтому  генные  вакцины  не  требуют  создания  так  называемых

холодовых цепочек (необходимость хранения вакцин  в  холодильных  установках

на всем пути от места производства до конечного потребителя).  Это  качество

дает им  значительные  преимущества  перед  другими  вакцинами,  так  как  в

некоторых развивающихся странах на поддержание холодовых цепочек  приходится

около 80% стоимости проведения одной вакцинации.  Таким  образом,  стоимость

транспортировки и хранения ДНК-вакцин будет значительно ниже.

    Возможные ограничения  в применении ДНК-вакцин

    Поскольку  гены  кодируют  синтез  белковых  молекул,  то   ДНК-вакцины

способствуют  формированию  иммунитета  только   в   отношении   протеиновых

компонентов болезнетворных микроорганизмов. Поэтому они  не  могут  заменить

вакцины,  действие  которых  основано  на  использовании  других  антигенных

молекул,  например  капсулярных  антигенов,  представленных   полисахаридами

(полисахаридные пневмококковые, менингококковые,  брюшнотифозные  вакцины  и

др.).

    Другое ограничение  связано с тем, что  молекулы  белков  после  синтеза

часто претерпевают в клетке  дальнейшие  биохимические  изменения,  например

подвергаются гликозилированию. Эти процессы в клетках человека,  животных  и

микроорганизмов могут протекать по-разному. Поэтому  существует  вероятность

того,  что  структура  антигенного  протеина,  синтезированного  в   клетках

человека,  будет  отличаться  от   структуры   натурального   иммуногенного

вирусного   протеина.   Результаты   проведенных   экспериментов   пока   не

подтвердили этих опасений.

    Кроме того, недостаточно  хорошо изучены  особенности  перорального  или

интраназального  применения  ДНК-вакцин.  Между  тем,   слизистые   оболочки

являются воротами инфекции для многих возбудителей заболеваний  и  известно,

что  для  ряда  патогенных  микроорганизмов  наиболее  эффективным   методом

иммунизации является инициация иммунного ответа в месте инфицирования.

 

3.2.6. Вопросы безопасности  применения

 

    Существуют опасения, что молекула ДНК-плазмиды может  встраиваться в ДНК

хромосом человека, что приведет к  мутации  гена  на  этом  участке.  Однако

эксперименты на мышах свидетельствуют, что интеграция плазмиды в  ДНК  мышей

наблюдается приблизительно в 1000 раз реже, чем спонтанные мутации генов.

    Известно также, что  иммунологическая  толерантность  (неспособность  к

иммунному ответу на антиген) может быть вызвана  повторным  введением  очень

низких доз антигена. При иммунизации посредством  ДНК  иммуногенный  протеин

также  синтезируется  в  организме  в   небольшом   количестве   в   течение

продолжительного времени. Эта проблема требует более  тщательного  изучения,

но,  по-видимому,  не  является  существенным   препятствием   в   связи   с

возможностью регулирования количества вводимой ДНК  и  соответственно  числа

клеток, синтезирующих антигенный белок.

    Высказывалось  предположение, что введение ДНК-вакцин  может приводить  к

развитию   аутоиммунных   заболеваний   в   результате   иммунной   реакции,

направленной против клеток организма  человека,  экспрессирующих  антигенный

протеин,  или  вследствие  образования  антител  к  чужеродной  ДНК.  Однако

проведенные эксперименты позволяют надеяться,  что  введение  ДНК-вакцин  не

повышает риск развития аутоиммунных реакций, во всяком случае  по  сравнению

с применяемыми в настоящее время аттенуированными вирусными вакцинами.

 

 

3.3.1. Методы генетической  трансфекции в генной терапии.

 

    Решающим условием  успешной генотерапии является  обеспечение эффективной

доставки, то есть  трансфекции  (в  широком  смысле)  или  трансдукции  (при

использовании  вирусных  векторов)  чужеродного  гена   в   клетки   мишени,

обеспечение длительного функционирования  его  в  этих  клетках  и  создание

условий для полноценной работы  гена  (его  экспрессии).  Трансфекция  может

проводиться с использованием чистой (голой) ДНК, встроенной  соответствующей

плазмиду, или комплексированной ДНК (плазменная ДНК, соединенная  с  солями,

белками, органическими полимерами),  или  ДНК  в  составе вирусных  частиц,

предварительно лишенных к репликации.

    Основные методы  доставки  чужеродных  генов  в  клетке  разделяются  на

химические, физические  и  биологические.  Эффективность  трансдукцированной

чужеродной ДНК  при  различных  способах  трансфекции  в  ДНК  клетки-мишени

(приведены  в  таблице  3).  Только  вирусные   векторы   или   генетические

конструкции, включающие вирусные последовательности,  способны   к  активной

трансдукции, а в некоторых случаях  и  к  длительной  экспрессии  чужеродных

генов. Из более 175  уже  одобренных  протоколов  клинических  испытаний  по

генной терапии более 120 предполагают использовать  вирусную  трансдукцию  и

около 100 из них основаны на применении ретровирусных векторов.

                                                                 

 

    Обзор данных  позволяет прийти к заключению, что несмотря  на

усилия многих лабораторий мира все усилия известные и испытанные in vitro  и

in vivo векторные системы  далеки от  совершенства.  Если  проблема  доставки

чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее  доставка  в  клетки-мишени

разных  in  vitro  успешно  решается   (главным   образом   путем   создания

конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены,  специфичные

для тех или иных тканей), то другие  характеристики  существующих  векторных

систем – стабильности интеграции, регулируемая  экспрессия,  безопасность  –

все еще нуждается в серьезных доработках.

    Прежде всего,  это  касается  стабильности  интеграции.  До  настоящего

времени  интеграция   в   геном   достигалась   только   при   использовании

ретровирусных  либо  аденоассоциированных  векторов  (таблица  3).  Повысить

эффективность стабильной интеграции  можно  путем  совершенствования  генных

конструкций  типа  рцептор-опосредованных  систем  (рис  4.),   либо   путем

создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть, ДНК –  структур,

способных к длительной персистенции внутри ядер). В последнее  время  особое

время  уделяется  созданию   векторов   на   базе   искусственных   хромосом

млекопитающих. Благодаря  наличию  основных  структурных  элементов  обычных

хромосом, такие мини хромосомы длительно удерживаются в  клетке  и  способны

нести полноразмерные гены и их естественные регуляторные  элементы,  которые

необходимы для правильной работы гена в нужной ткани и в должное время.

 

 

 

                 Глава 4. Перспективы клонирования  животных

 

    Идея  клонирования  животных,  т.е.  получение  генетически  идентичных

копий,  родилась  благодаря  успешным  экспериментам   по   пересадке   ядер

дифференцированных  клеток  в   энуклеированные   яйцеклетки   или   ооциты,

выполненным на амфибиях. Цель этих экспериментов была  сугубо  теоретическая

- выяснить вопрос, способно  ли  ядро  (геном)  дифференцированной  клетки  к

репрограммированию   и   восстановлению   тотипотентности,   т.е.,    будучи

помещенным в цитоплазму яйца, способно ли  оно  обеспечить  полное  развитие

подобно  оплодотворенной  яйцеклетке.  Фактически  речь  шла  о  возможности

обратимости эмбриональной дифференцировки и выяснению вопроса:  претерпевает

ли  геном  в  процессе  развития  необратимые  изменения  или   модификации?

Успешные опыты J.Gurdon и его сотрудников, показавшие  возможность  развития

взрослых амфибий из реконструированных  яйцеклеток  после  трансплантации  в

них ядер из клеток эпителия кишечника плавающей личинки (головастика),  были

интерпретированы    как    убедительное    доказательство,     что     геном

дифференцированных  клеток  способен  к  репрограммированию   в   цитоплазме

яйцеклетки и восстановлению тотипотентности, подобно оплодотворенному  яйцу.

Из этих результатов логично вытекало, что используя  технику  трансплантации

ядер из соматических клеток  взрослых  особей  в  энуклеированные  яйца  или

ооциты, можно получать  генетические  копии  животного,  служившего  донором

ядер дифференцированных клеток. Безусловно, клонирование животных  открывало

бы заманчивые перспективы для  генетического  копирования  животных,  прежде

всего сельскохозяйственных,  тех,  которые  имеют  те  или  иные  выдающиеся

показатели продуктивности.

    Однако первые  попытки применить описанный  выше подход для  клонирования

млекопитающих  были   безуспешными   и   даже   скандальными.   Сенсационные

результаты  Illmensee  по  рождению  мышей,  развившихся   после   пересадки

кариопластов  из  разных  частей  предимплантационных   эмбрионов   мыши   в

энуклеированные яйца, не  были  подтверждены  другими  исследователями.  Эти

результаты  вызвали  еще  большие   сомнения   после   заявления   лаборанта

Illmensee, что результаты опытов Illmensee были фальсифицированы.  В  начале

80-х годов эксперименты  по трансплантации ядер дифференцированных  клеток  в

энуклеированные яйца  или  ооциты  показали,  что  у  мышей  тотипотентность

утрачивается после 2-го деления-дробления. Другой  экспериментальный  подход

для  изучения  тотипотентности   эмбрионов   был   основан   на   разделении

бластомеров  на  ранних  стадиях  развития  (до   16-клеточной   стадии)   и

независимой   их   трансплантации   приемным   матерям.   Результаты    этих

экспериментов показали, что у мышей тотипотентность  утрачивается  после  4-

клеточ-ной стадии, хотя у овец такая  потеря  происходит  на  более  поздней

стадии развития (после 16-клеточной  стадии).  Открытие  импринтинга и  его

существенной роли в развитии млекопитающих сделало еще более  проблематичной

возможность   клонирования   млекопитающих,   поскольку   выяснилось,    что

материнский и отцовский геномы имеют  разный  вклад  в  нормальное  развитие

эмбриона,  причем   эти   функциональные   различия   родительских   геномов

формируются  в  процессе  овогенеза  и  сперматогенеза,   импринтируются   и

реализуются в течение всего онтогенеза.

    Тем  не  менее,  исследования  тотипотентности  и  плюрипотентности   в

эмбриональном    развитии    продолжались     с     использованием     новых

экспериментальных подходов. Уже в конце  80-х  годов  стало  очевидным,  что

ооцит  на  стадии  М2  (второе  меойтическое  деление)  обладает  факторами,

способными  репрограммировать  геном  клеток,   полученных   из   внутренней

клеточной массы бластоцисты после их трансплантации в энуклеированный  ооцит

М2. Здесь следует отметить значительный  вклад  в  разработку  этой  техники

шотландской  группы   исследователей   под   руководством   Ian   Wilmut   и

американских исследователей Keefer, Mathews и First. В  1996  г.  вышли  две

публикации по успешному рождению ягнят и развитию эмбрионов коров  до  80-85