Хроматография, как метод анализа лекарственного растительного сырья

Характерные химические вещества, выступающие в роли маркеров для конкретных видов лекарственного растительного сырья, часто содержатся в растениях в весьма небольших концентрациях, поэтому чрезвычайно важно выбрать подходящий растворитель, на основе которого будут готовиться растительные экстракты для газохроматографического анализа. Извлечение должно быть по возможности максимальным.

Метод газовой хроматографии применяется для анализа летучих веществ, в том числе компонентов эфирных масел, например ледола и палюстрола в эфирном масле побегов багульника болотного.

Багульник болотный - Ledum palustre - являет собой пример растения с присущими ему весьма специфическими соединениями. Это, прежде всего, производное азулена ледол, получивший свое название от латинского наименования данного растения, а также его изомер палюстрол. Относительное содержание ледола и палюстрола в экстракте на основе ацетонитрила составляет, соответственно, 10,69±0,53 % и 12,52±0,56 % . Относительное содержание ледола и палюстрола составляет в экстракте на основе этилового спирта 0,46±0,02 % и 0,52±0,02 %.

Также возможно проведение химической модификации (дериватизации) компонентов анализируемой смеси с целью получения летучих производных и их последующий анализ методом ГХ. В качестве примера газохроматографического анализа с использованием дериватизации можно привести анализ летучих производных карбоновых кислот и моносахаридов, в том числе и растительного происхождения.

6. На базе колоночной хроматографии возникла высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). От классической колоночной хроматографии ВЭЖХ отличается использованием сорбентов с размером частиц 3-10 мкм, что обеспечивает быстрый массоперенос при очень высокой эффективности разделения. Для обеспечения беспрепятственного прохождения элюента через колонку с ультрамелким сорбентом на входе в хроматографическую систему создается высокое давление. Поэтому другим названием ВЭЖХ является «жидкостная хроматография высокого давления».

Лидирующее положение занимает обращённо-фазовая ВЭЖХ, в которой используются сорбенты на основе силикагеля с привитыми на его поверхности молекулами неполярных соединений, таких как высокомолекулярные углеводороды, фенолы и их производные. При этом хроматографическое разделение происходит за счёт распределительного (главным образом) и адсорбционного (в меньшей степени) механизмов, детектирование в ВЭЖХ осуществляется с помощью фотометрических и электрохимических методов анализа. Основное значение имеет спектрофотометрическая детекция в УФ области.

Преимуществом ВЭЖХ (особенно обращённо-фазовой) перед газовой хроматографией является возможность исследования практически любых объектов без каких-либо ограничений по их физико-химическим свойствам. Поэтому подавляющее большинство действующих веществ лекарственного растительного сырья может быть проанализировано этим методом (рис. 6). В фармацевтическом анализе метод ВЭЖХ в настоящее время используется главным образом при анализе препаратов на основе лекарственного растительного сырья, такого как женьшень, родиола розовая, шиповник и др.

 

 

 

2. Газоадсорбционная хроматография

Особенность метода газоадсорбционной хроматографии (ГАХ) в том, что в качестве неподвижной фазы применяют адсорбенты с высокой удельной поверхностью, и распределение веществ между неподвижной и подвижной фазами определяется процессом адсорбции. Адсорбция молекул из газовой фазы, т.е. концентрированных на поверхности раздела твердой и газообразной фаз, происходит за счет межмолекулярных взаимодействий (дисперсионных, ориентационных, индукционных), имеющих электростатическую природу. Адсорбционная активность зависит от удельной поверхности (определяется геометрической структурой носителя) и удельной поверхностной энергии (определяется химической структурой поверхности). Возможно, образование водородной связи, причем вклад этого вида взаимодействия в удерживаемые объемы значительно уменьшается с ростом температуры. Комплексообразование для селективного разделения веществ в ГХ используют редко.

В качестве адсорбентов для ГАХ в основном используют активные угли, силикагели, пористое стекло, оксид алюминия. Неоднородностью поверхности активных адсорбентов обусловлены основные недостатки метода ГАХ и невозможность определения сильно адсорбирующихся полярных молекул. Однако на геометрически и химически однородных макропористых адсорбентах можно проводить анализ смесей сильнополярных веществ. В последние годы выпускают адсорбенты с более или менее однородной поверхностью, такие, как пористые полимеры, макропористые силикагели (силохром, порасил, сферосил), пористые стекла, цеолиты.

Достоинствами адсорбентов в качестве неподвижных фаз являются способность выдерживать высокие температуры, отсутствие фонового сигнала при работе с ионизационными детекторами и высокая селективность.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Для аналитической практики важно, чтобы при постоянной температуре количество адсорбированного вещества на поверхности Сs было пропорционально концентрации этого вещества в газовой фазе Сm:

Cs = к*Сm,

т.е. чтобы распределение происходило в соответствии с линейной изотермой адсорбции (к — константа). В этом случае каждый компонент перемещается вдоль колонки с постоянной скоростью, не зависящей от его концентрации. Разделение веществ обусловлено различной скоростью их перемещения. Поэтому в ГАХ чрезвычайно важен выбор адсорбента, площадь и природа поверхности которого обусловливают селективность (разделение) при заданной температуре.

Если разделяют соединения, сильно различающиеся по летучести при постоянной температуре, то низкокипящие вещества элюируются быстро, высококипящие имеют большее время удерживания, их пики на хроматограмме будут ниже и шире, анализ занимает много времени. Если же в процессе хроматографирования    повышать    температуру  колонки с постоянной скоростью (программирование температуры), то близкие по ширине пики на хроматограмме будут располагаться равномерно.

 

Методика количественного определения каротина в плодах рябины обыкновенной (Fructus Sorbi).

Метод основа на экстракци каротина органическими растворителями (ацетон, бензин), очистку сопутствующих веществ методом хроматографической адсорбции. Количество каротина в очищенном растворе определяют колориметрически по интенсивности желтой окраски раствора сравнением его с раствором азобензола или раствором дихромата калия, который стандартизован по чистому каротину.

5—20 г измельченного сырья тщательно растирают в ступке с кварцевым песком или стеклянным порошком. Так как каротин в кислой среде неустойчив, то для нейтрализации кислот при растирании добавляют немного карбоната натрия. После растирания в ступку постепенно прибавляют 10 мл ацетона и снова растирают материал. Затем содержимое ступки фильтруют под вакуумом, смывают ступку ацетоном и промывают материал на фильтре небольшим порциями ацетона до исчезновения окраски стекающего фильтрата. Ацетоновый экстракт переносят в делительную воронку. Чтобы перевести пигмент в бензин, к экстракту в делительной воронке добавляют 10—20 мл бензина и смесь тщательно перемешивают. Ацетон из смеси удаляют промыванием водой, добавляя её в делительную воронку небольшими порциями и слегка встряхивая смесь. Промывные воды сливают, они не должны содержать растворимых в бензине пигментов.

Полностью освобожденный от ацетона бензиновый раствор сушат фильтрованием через безводный сульфат натрия. После этого хроматографической адсорбцией в бензиновом растворе отделяют каротин от хлорофилла, ксантофилла, ликопина и других пигментов.

На дно хроматографической колонки (диаметр 1—1,5 см, длина 15—20 см) плотно вставляют ватный тампон толщиной 1 см, который препятствует прохождению адсорбентов в приемник. Затем в колонку вносят небольшими порциями оксид алюминия, слегка уплотняя каждую порцию стеклянной палочкой. Длина столбика адсорбента в колонке должна составлять 5—7 см. Бензиновый раствор пигментов при слабом отсасывании пропускают через хроматографическую колонку (необходимо следить, чтобы на поверхности адсорбента постоянно был слой бензина, так как каротин окисляется под действием воздуха). Затем через колонку пропускают чистый бензин, пока весь каротин, отделяясь о других пигментов в виде желтой полоски, не пройдет в приемник. Каротин адсорбируется оксидом алюминия слабее других пигментов. Конец хроматографирования определяют по исчезновению желтой окраски вытекающего из колонки элюата. Бензиновый раствор каротина переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят бензином до метки. Так как химически чистый каротин нестойкое вещество, то при колориметрировании в качестве стандартного раствора используют раствор азобензола или раствор дихромата калия.

При колориметрировании в одну кювету наливают стандартный раствор, а в другую раствор каротина. Если раствор каротина получается слишком концентрированным, то рекомендуется перед колориметрированием разбавить его бензином.

Процентное содержание суммы каротиноидов вычисляют по формуле

X = ,  где

К – количество каротина в 1 мл стандартного раствора равно 0,00208 мг, если стандартный раствор – дихромата калия, и 0,00235 мг, если стандартный раствор – азобензол; V – объем бензинового раствора каротина, мл; – оптическая плотность стандартного раствора; - оптическая плотность исследуемого раствора каротина; m – масса навески абсолютно сухого сырья, г; w – потеря в массе сырья при высушивании, %. (Химический анализ лекарственных растений, Ладыгина Е.Я.)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение.

Обеспечение надлежащего качества лекарственного растительного сырья во многом зависит от правильной организации контроля, его действенности и эффективности, а также от уровня требований, заложенных в нормативной документации, и используемых методов анализа.

Государственная система контроля качества лекарственных средств охватывает все стадии изыскания, апробации, производства и применения лекарственных средств. В равной степени это относится и к контролю качества лекарственного растительного сырья.

Методы хроматографии включены в ФС к различным лекарственным растениям как главные методы их контроля качества. Так же в ГФ создана ФС «Хроматография», которая стандартизирует метод.

С помощью хроматографии можно стандартизировать и делать оценки подлинности веществ не только в пищевой, парфюмерной и других отраслях промышленности, но и различного лекарственного сырья в медицине, фармакологии, здравоохранении.

Изучив и проанализировав методы хроматографического анализа, можно сделать вывод, что хроматография в анализе лекарственного растительного сырья является одном из точных, быстрых и экономичных методов качественного и количественного анализа лекарственного растительного сырья. С помощью хроматографических методов анализа можно не только качественно обнаружить биологически активные соединения (БАС) в лекарственном растительном сырье, но и их количественное содержание. Так же данным методом возможно разделение БАС перед их количественным и качественным анализом с помощью других методов анализа: потенциометрии, УФ - спектрофорометрии, ИК – сперктрофотометрии и других.

Известны способы и устройства для стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС) и фитопрепаратов (ФП) на их основе, основанные на определении биологически активных соединений (БАС) и стандартных образцов сравнения (СО) с использованием различных видов хроматографии и УФ-спектроскопии. Данные методы позволяют быстро и надежно оценить качество сырья по ведущей группе БАС.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список использованной литературы:

1. Государственная фармакопея СССР. XI издание. – М.: Медицина. - Вып. 1, 1987. – 336 с. - Вып. 2, 1990. – 400 с.
2. Долгова А.А., Ладыгина Е.Я. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии. – М.: Медицина, 1977. – 256 с.
3. Избранные лекции по фармакогнозии: Учебное пособие / Под ред. Г.И. Олешко. – Пермь: ПГФА, 2006. – 305 с.
4. Коноплева М. М. Фармакогнозия : природные биологически активные вещества. Витебск, 2007.273 с.
5. Кузьменко А.Н. Стандартизация лекарственного растительного сырья и растительных сборов хроматографическими методами (монография) / Кузьменко А.Н., Решетняк В.Ю. // Москва, Изд. Моск. ун-та, 2010,

104 с.

6. Кузьменко А.Н. Стандартизация растительного сбора методом газо-жидкостной хроматографии / Кузьменко А.Н. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2 Химия. – 2009. – Т. 50, № 4. – С. 278-281.
7. Кузьменко А.Н. Использование метода газо-жидкостной хроматографии для стандартизации лекарственных растительных сборов / Кузьменко А.Н. // Фармацевтический вестник Узбекистана. – 2009. – № 2. – С. 32-36.
8. Кузьменко А.Н. Использование газо-жидкостной хроматографии для стандартизации лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на его основе / Кузьменко А.Н. // Рос. хим. ж. (Журн. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). – 2010. – Т. LIV, №6. – С.114-119.
9. ОФС «Хроматография»
10. Химический анализ лекарственных растений: Учеб.пособие для фармацевтических вузов / Ладыгина Е.Я., Сафронич Л.Н. – М.: Высш. Школа, 1983. – 176 с., ил.