Микробиология

            Исследованный материал в процессе  наблюдения находится в вакууме,  быстро нагревается и разрушаться  под действием пучка электронов. Фотографировать необходимо для регистрации информации в том случае, если требуется длительное изучение образца.

          Сканирующий  электронный микроскоп

          В нем очень точно сфокусированный  пучок электронов двигается взад  и вперед по поверхности образца, а отраженные от его поверхности электроны собираются и формируют изображение, наподобие того, которое возникает на экране телевизора. Преимущество этого метода заключается в том, что детали строения поверхности видны с большей глубиной резкости, что создает эффект трехмерности. Разрешающая способность ниже, чем у трансмиссионного электронного микроскопа (5-20 нм), но при этом можно работать с образцами большего размера.

 

 

 

      Кроме микроскопа, для проведения микроскопии необходимы:

• предметные и покровные стёкла. Предметные стёкла могут быть плоские и с лункой. На них наносится исследуемая жидкость или ткань. Покровные стёкла имеют толщину 0,17 мм (Очень хрупкие!) и служат для покрытия препарата. Стёкла должны быть совершенно чистые и обезжиренные (капли воды на них должны расплываться). Для быстрого обезжиривания применяется следующий способ: стёкла натирают мылом и затем вытирают насухо ваткой или марлей. Пыльное стекло можно протереть спиртом или ацетоном.
• бактериологическая петля – титановая или из нержавеющей стали. Используется для забора культуры и нанесении её на предметное стекло, а так же при посеве микроорганизмов на питательные среды. Перед использованием петлю необходимо стерилизовать в открытом пламени. Для чего петлю несколько раз проводят в верхней части пламени спиртовки или газовой горелки не допуская её раскаления.
• скальпель или острая бритва – используются для приготовления срезов тканей высших животных и растений.
• пинцет и иглы – служат для равномерного распределения срезов на предметном стекле.

 

 

Подготовка материала для работы с микроскопом

 

           Биологические объекты можно  исследовать как живыми, так и фиксированными, окрашенными и неокрашенными. Из исследуемого объекта можно приготовить временные или постоянные препараты.

Постоянные препараты

 

1. Фиксация. Это сохранение материала в состоянии, близком к естественному. Для фиксации необходимо быстро умертвить ткани. Это лучше достигается при работе с небольшими кусочками живого материала. Используемое для этого вещество называется фиксатором (см. табл. 4). Быстрой фиксацией обеспечивается сохранение изначальной структуры объекта, причем ткани уплотняются настолько, что с них можно готовить тонкие срезы.

2. Обезвоживание. Обезвоживание проводится при подготовке материала к заливке (см. ниже п. 4) или для заключения его в соответствующую среду (см. ниже п. 7), которая не смешивается с водой. Воду необходимо удалить также потому, что иначе со временем препарат будет разрушен бактериями. Для того чтобы сохранить ультраструктуру, обезвоживание надо проводить постепенно, обрабатывая материал рядом водных   растворов этанола или пропанона (ацетона) со все возрастающей концентрацией, и закончить обработку «абсолютным» этанолом или пропаноном.

3. Просветление. Некоторые из общеупотребимых сред для заливки и заключения не смешиваются со спиртом. Поэтому его надо постепенно замещать средой (просветляющее вещество), с которой заливочная среда смешивается, например ксилолом. Это приводит также к тому, что материал становится прозрачным.

4. Заливка. Для того чтобы с помощью микротома получить очень тонкий срез, необходимо, чтобы материал был залит в определенную среду. При приготовлении препаратов для световой микроскопии объекты заливают в парафин, которому затем дают застыть. При приготовлении препаратов для электронной микроскопии необходимо использовать более твердые вещества (пластмассы или смолы), потому что необходимые в этом случае более тонкие срезы требуют для своего приготовления более плотные вещества.

5. Изготовление срезов. Как правило, толщина кусочков материала слишком велика, чтобы сквозь них могло пройти достаточное для исследования под микроскопом количество света. Обычно приходится срезать очень тонкий слой исследуемого материала, т. е. готовить срезы. Срезы можно делать бритвой или на микротоме. Вручную срезы готовятся с помощью остро отточенной бритвы. Для работы на обычном микроскопе толщина среза должна равняться 8-12 мкм. Не залитую ткань следует закрепить между двумя кусочками сердцевины бузины. Бритву смачивают жидкостью, в которой хранилась ткань; срез делают через бузину и ткань, причем бритву держат горизонтально и двигают ее к себе медленным скользящим движением, направленным чуть вкось. Быстро сделав несколько срезов, следует выбрать из них самый тонкий, содержащий характерные ткани.

Срез с ткани, залитой  в ту или иную среду, можно сделать  на микротоме.

6. Окрашивание. Как правило, биологические структуры на препаратах прозрачны, поэтому для получения контраста между ними приходится прибегать к окрашиванию. Некоторые красители, используемые в световой микроскопии, перечислены в табл.4.

        Определенные красители при использовании  их в низких концентрациях  не токсичны для живых тканей  и поэтому могут применяться  для окрашивания живых организмов. Они называются прижизненными (витальными) красителями. К ним относятся такие, как метиленовый синий и нейтральный красный.

         При окрашивании парафиновых  срезов парафин удаляют с помощью растворителя, а срез частично обводняют перед окрашиванием.

7. Заключение. Полностью окрашенные срезы заключают на предметном стекле в специальную среду, например в канадский бальзам, которая не пропускает воздух и способна неограниченно долго сохранять срез. Заключенный в среду срез покрывают покровным стеклом. Последовательность описанных выше действий является типичной при приготовлении тонких срезов для постоянных препаратов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис.5     Заключение образца  и наложение покровного стекла на предметное.

 

 

 

Временные препараты

 

           Временные препараты для светового  микроскопа в отличие от постоянных можно сделать сравнительно быстро. Они готовятся для проведения быстрых предварительных исследований, а так же для изучения живых объектов.

 

Изучение микроорганизмов и  тканей в неокрашенном виде

 

          В неокрашенном виде микроорганизмы изучают с помощью раздавленной или висячей капли, в тёмном поле зрения, в негативных препаратах и люминесцентной микроскопией.

          Раздавленную  каплю готовят следующим образом.  На середину предметного стекла  наносят каплю исследуемого материала (взвесь микроорганизмов). Затем каплю покрывают сверху покровным стеклом так, чтобы не было воздушных пузырьков. Препарат исследуют (быстро, так как капля высыхает) с помощью сухих объективов при опущенном конденсоре и суженной диафрагме. Под микроскопом на сероватом фоне обнаруживаются живые микроорганизмы, появляющиеся в разных плоскостях.

          Для приготовления висячей капли  используют предметное стекло  с углублением – «лункой» и  покровное стекло.

 

 

      Рис. 6  Висячая  капля

 

 

 

 

 

          На середину покровного стекла  наносят каплю исследуемой среды,  затем край лунки предметного  стекла смазывают вазелином и  покровное стекло переворачивают  над  центром лунки так, чтобы  капля свободно висела в углублении, не соприкасаясь с дном и её краями. Таким образом, получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. Микроскопическая картина такая же, как и в раздавленной капле. Раздавленную и висячую каплю применяют для изучения подвижности микроорганизмов или изучения наиболее крупных представителей.

          Микроорганизмы можно наблюдать  в тёмном поле. Для этого употребляется  конденсор с затемнением в  центре, пропускающий только боковые  косые лучи. При отсутствии специального  конденсора затемнение можно  получить с помощью тёмного диска из чёрной бумаги. При освещении косыми лучами мы получаем светящиеся изображение.

          Весьма чёткое представление  о микроорганизмах дают негативные  препараты. Для получения негативных  препаратов используют тушь или  концентрированные растворы красок (3 % раствор конгорот или 10 % нигрозин). Эти вещества создают фон, на котором хорошо видны не окрашенные микроорганизмы. Техника приготовления  таких препаратов следующая. На предметное стекло, ближе к краю, наносят каплю туши или другой краски и рядом каплю культуральной жидкости. Делают мазок. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над огнём и рассматривают под иммерсионным объективом.

          Люминесцентная микроскопия основана  на свойстве некоторых веществ  светится при освещении коротковолновым светом (ультрафиолетовым, синим). Если объект изучения содержит вещества, способные флуоресцировать, то это первичная люминесценция. Чаще используется явление вторичной люминесценции, при которой происходит свечение объекта после его обработки специальными красителями – флюорохромами (акридиновый жёлтый, акридиновый оранжевый, аурофосфин и т.д.). Для люминесцентной микроскопии используют обычный микроскоп с набором светофильтров и источником ультрафиолетового света.

            Для изучения клеток высших животных и растений можно использовать отдельные клетки (мазок крови), но чаще приходится сталкиваться с различными тканями – многослойными структурами, вследствие чего невозможно их непосредственное рассмотрение в световой микроскоп. Из тканей готовят срезы. Срез свежего материала можно сделать вручную с помощью бритвы непосредственно в 70% спирте, который служит фиксатором. В общем, технология приготовления среза такая же, как при изготовлении постоянных препаратов.

 

Изучение микроорганизмов и тканей в окрашенном виде

 

          В природе  существует целый набор пигментов  окрашивающих различные микроорганизмы  и ткани высших растений и  животных. Но большинство микроорганизмов  бесцветны, что затрудняет их  детальное рассмотрение под микроскопом. Поэтому микроорганизмов большей частью исследуют в окрашенном виде. Используя специальные красители, взаимодействующие только с определённым химическим веществом, удаётся окрасить в разные цвета, различающиеся по химическому составу компоненты клетки. Таким образом, получается «раскрашенное» изображение клеточных структур с подробным «изложением» их химического состава.

            Различают простые и сложные способы окрашивания. При простом окрашивании используется один краситель, при сложном – окрашивание происходит последовательно несколькими красителями.

 

             Простое окрашивание срезов.

             Каждый срез следует помещать  на чистое предметное стекло (предварительно протертое спиртом) и капнуть несколько капель красителя. Затем препарат покрывают тонким покровным стеклом, чтобы предотвратить попадание воздуха и пыли и предохранить от загрязнения объектив большого увеличения. Если образец начнет подсыхать или если заранее известно, что потребуется длительное изучение (более 10 мин), то после окрашивания препарат следует заключить в глицерин.

 

              Простое окрашивание микроорганизмов. 

              Приготовление окрашенного препарата  складывается из следующих моментов: приготовление мазка, высушивания,  фиксации и окраски.

              Приготовление мазка. Мазки готовят на абсолютно чистых стёклах. Исследуемый материал набирают стерильной петлёй и наносят на край предметного стекла, где размазывают в виде широкой полосы. Если материал густой (агаровая культура), то он эмульгируется в капле воды или физиологического раствора, предварительно нанесённой на предметное стекло. Второе предметное стекло подставляют к жидкости на первом стекле под углом в 45^о. Вторым стеклом проводят по первому, размазывая жидкость (см. рис. 7). Необходимо добиться средней плотности мазка, где культура была бы распределена равномерно. Мазок высушивают при комнатной температуре.

 

Рис. 7. Приготовление мазка

            

 

              Фиксация. При фиксации микроорганизмы убиваются и прикрепляются к стеклу. В таком состоянии они не смываются, теряют подвижность, лучше окрашиваются. Нельзя фиксировать не высохшие мазки. Наиболее часто применяется фиксация жаром, которая производится быстрым троекратным проведением предметного стекла мазком вверх над пламенем горелки. Для изучения тонкого строения клетки  применяется химическая фиксация. Можно использовать заливку этиловым спиртом (96 %), либо препарат помещают в чашку Петри мазком вниз над каплей фиксатора, образующего пары.

 

 

Таблица 3.  Основные фиксирующие жидкости.

 

Фиксирующие жидкости	Время фиксации, мин.
96 % этанол	10 – 15
Метанол безводный	3 – 5
Смесь Никифорова (Этиловый спирт и серный эфир, 1:1)	10 – 15
Спиртформол (40 %-ного формалина  – 5мл, 96 % этанола – 95 мл)	5 – 10
Пара 1-2 %-ного раствора осмиевой кислоты	3 – 5
Пары 40 %-ного формалина	несколько секунд
Фиксатор Карнуа (96%-ного этанола – 60 мл, хлоро-форма – 30 мл, ледяной уксусной кислоты – 10 мл)	15