Ферменты

      Полную  информацию о детальном механизме  ферментативных реакций с участием ряда промежуточных соединений дает изучение процесса в нестационарном режиме. Необходимо отметить, что формально-кинетическому анализу стационарной кинетики ферментативных реакций посвящено достаточно много обзоров и монографий [14, 22, 34 – 36] в то время как отсутствует полное и последовательное изложение данных нестационарной ферментативной кинетики.

      Предстационарный  и релаксационный режимы исследования ферментативных реакций [17, 22, 36 – 38] представляют собой наиболее часто используемые и хорошо разработанные способы исследования механизмов реакций в нестационарном режиме.

      Исследование  нестационарной кинетики ферментативных реакций связано с использованием экспериментальных методов исследования кинетики "быстрых" реакций в  растворе, так как период протекания нестационарной ферментативной реакции достаточно мал.

      Использование совокупности разных физико-химических методов для обоснования кинетической модели приводит одновременно к результатам, дающим вместе с тем и важнейшую  информацию о механизме процесса. Эти же данные способствуют одновременно уточнению самой модели. Возникает вопрос: чем отличается кинетическая модель от механизма реакций?

      Согласно [39] кинетическая модель – количественная характеристика скорости каталитического процесса в виде ее математического описания по разным реализуемым в данных условиях направлениям, обоснованная определенными стационарными схемами, учитывающая существенные сопутствующие эффекты, в том числе влияние реакционной системы на катализатор. Механизм реакции – всесторонняя качественная характеристика ее внутренних закономерностей, отражающая последовательность элементарных стадий, их сопряжение, природу промежуточных соединений с учетом побочных взаимодействий в данных условиях.

      Итак, в кинетической модели главное - количественное описание скорости процесса, а в механизме реакции - качественное описание природы промежуточных соединений и их взаимосвязи.

      Известно, что активность фермента может быть уменьшена с помощью разнообразных  воздействий. Такое снижение скорости ферментативных реакций принято называть торможением, или ингибированием. Большое значение для регуляции действия ферментов in vivo имеют изменения их активности при связывании специфических реагентов функциональными группами, находящимися вне активного центра белковой молекулы. Такое взаимодействие приводит к изменению конформации ферментов и его активности. Оно может быть конкурентным и неконкурентным [11, 14, 15, 34, 40 – 42].

      Ингибиторный  анализ не может ограничиваться качественной оценкой действия или не действия вещества на активность фермента. Обязательный элемент анализа - количественная оценка реакционной способности ингибитора, которая может быть дана с помощью кинетических параметров.

      По  механизму взаимодействия с ферментами ингибиторы делятся на две большие группы. Ингибиторы, снижающие активность фермента в результате взаимодействия с теми же самыми центрами фермента, что и субстраты, называются конкурентными. Ингибиторы, которые снижают активность фермента вследствие реакции с другими функциональными группами, носят название неконкурентные. В первом случае ингибитор образует неактивное соединение только со свободным ферментом. Во втором случае (неконкурентное ингибирование) ингибитор взаимодействует со всеми формами ферментов.

      На  практике нередко встречаются случаи смешанного торможения, когда один и тот же ингибитор может реагировать со свободным ферментом в разных точках, а также с фермент-субстратным комплексом на разных стадиях его превращения [14, 17, 34, 40, 42]. Существуют и такие виды ингибирования как бесконкурентное и псевдоингибирование [34, 40, 42].

      Псевдоингибирование ферментов не нашло широкого признания  в энзимологии [14, 18, 34, 43, 44], хотя в практике накопилось достаточно экспериментальных данных, подтверждающих его существование. Псевдоингибирование интересно тем, что, несмотря на соотношение начальных скоростей реакций v_i < v ₀ , типичное для ингибирования и выполнимое на всем интервале обратных концентраций расщепляемого субстрата, прямая ингибируемой реакции пересекает прямую исходной реакции в первом квадранте координат Лайнуивера-Берка.

      Отнесение данного типа ингибирования к  псевдоингибированию обусловлено  тем, что присутствие таких ингибиторов  приводит не к уменьшению, а к  увеличению максимальных скоростей  реакций, что более типично для активации. Однако к активируемым реакциям этот тип не подходит, поскольку первичный эффект, проявляющийся в уменьшении  начальной скорости (v_i < v ₀ ) – признак ингибирования, а не активации.

      Исследованию  активации ферментов, разработке практических и теоретических аспектов этого эффекта в литературе уделялось значительно меньше внимания, чем ингибированию. В книгах [34, 40, 45, 46] рассмотрена активация ферментов другими соединениями.

      На  активность фермента также влияет рН среды и температура [11, 14, 15, 18, 34]. Причины влияния рН на скорость ферментативной реакции состоят в том, что белковая молекула фермента является амфотерным полиэлектролитом, каталитический эффект которого зависит от степени ионизации функциональных групп, определяющих структуру и реакционноспособность активного центра фермента. В связи с этим исследования рН-зависимости скорости ферментативных реакций играют важную роль в идентификации ионогенных групп ферментов, участвующих в каталитическом процессе.

      Исследование  температурной зависимости позволяет определить термодинамические характеристики реакций ферментативного катализа (вычисление энергии активации, энтальпии, свободной энергии) [34].

      Практическому использованию ферментов до 70-х  годов мешала их низкая устойчивость и дороговизна. Усовершенствование методов очистки ферментов значительно снизило их стоимость и повысило доступность. Однако основные успехи, позволившие широко использовать ферменты, связано с получением иммобилизированных ферментов [47, 48]. Идея «пришить» фермент к матрице появилась еще в конце 40-х годов, а была реализована только в начале семидесятых. Основная технологическая проблема заключалась в поиске подходящих матриц (как правило, это полимерные молекулы). Фермент присоединяется к ним химическим путем (ковалентными связями), однако в ряде случаев соединение происходит за счет электрических или гидрофобных связей. Иногда можно просто инкапсулировать фермент внутрь полимерного микроконтейнера, липидного бислойного пузырька (липосомы) или обволакивающего гелеобразного соединения [49, 50]. Матрица может быть как растворимой в воде, так и нерастворимой. Нерастворимые носители позволили использовать ферменты в технологических процессах. Можно иммобилизировать целые клетки [51, 52]. Например, в производстве этилового спирта в настоящее время широко используются иммобилизированные клетки дрожжей.

      В настоящее время энзимология  – это обширная область знания с многочисленными ответвлениями  в другие науки. Она тесно связана  с биохимией, бактериологией и микробиологией, генетикой, ботаникой, а также фармакологией, физиологией и медициной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

      Ферменты  играют исключительно важную роль во всех процессах жизнедеятельности, направляя и регулируя обмен  веществ. Поэтому любое нарушение  действия ферментов может повлечь за собой серьезные последствия для живого организма. В связи с этим особое значение приобретает знание факторов, провоцирующих не только изменение каталитической активности ферментов, «отравляющих» их, но и нарушающих их способность к взаимодействию с другими внутриклеточными партнерами реакции, нарушающих способность к регуляции. При изучении активности фермента в пробирке (in vitro) не всегда удается выявить такие отклонения, так как они могут проявляться только внутри клетки в организме (in vivo).

      Поэтому можно сказать, что перспектива дальнейшего развития энзимологии связана с поиском путей исследования поведения ферментов в целой клетке.

      В настоящее время задача определения  активности ферментов непосредственно  в клетках организма является исключительно сложной. В очень  редких случаях можно приблизительно судить об уровне внутриклеточной активности ферментов, определяя, например, в сыворотке крови, продукты их деятельности. Иногда для этой цели используется изотопный метод.

      Хорошо  разработана техника выявления  какого-либо фермента в клетке иммунными  методами. Для этого предварительно получают высокоспецифичные антитела (принцип образования комплекса антиген – антитело).

      Судить  о наличии в клетке определенного  фермента можно также по нуклеотидной последовательности молекул нуклеиновых  кислот, характерной для данного  фермента.

      Были  попытки проследить функции отдельных  ферментов, получая линии мышей, у которых отсутствует какой-либо фермент. И очень часто никаких изменений у организмов выявить не удавалось. Может быть клетки могут включать дублирующие механизмы, позволяющие компенсировать отсутствие данного фермента? А может быть неизвестно, где эти отклонения искать и какова форма их проявлений и время?

      Исследования, проведенные в последнее десятилетие  свидетельствуют о том, что ферменты in vivo образуют структурные комплексы и ансамбли как друг с другом, так и с участниками клеточных и внутриклеточных мембран. Их функциональное значение пока не ясно. Однако, существует предположение, что образование таких комплексов регулирует активность ферментов.

      К настоящему времени полностью определена трехмерная пространственная структура  сотен ферментов, изучены кинетические характеристики и механизмы их действия. Но до полного понимания внутриклеточных механизмов регуляции действия ферментов еще далеко.

      Нет ясного и четкого ответа даже на вопрос о субстратной специфичности  фермента в клетке и пробирке, совпадают они или нет? Ведь выделенные из клетки индивидуальные белки или их комплексы могут оказаться либо результатом распада естественного комплекса, либо – нехарактерного объединения изначально изолированных ферментов.

      Применение  метода сайт-специфического мутагенеза (строго заданных единичных замен в нуклеотидных последовательностях белков) показало, что многие мутации для функционирования белков несущественны. В то же время иногда замена всего лишь одной аминокислоты меняет функцию белка коренным образом.

      Путем сайт-специфического мутагенеза иногда удается повысить устойчивость некоторых  ферментов к воздействию различных  денатурирующих агентов. Стабильность ферментов можно повысить в сотни  и тысячи раз в результате иммобилизации  ферментов (присоединении их к матрице носителя). Способы иммобилизации подбираются так, чтобы сохранить активность фермента или изменить в нужном направлении. Путем иммобилизации можно менять не только стабильность и активность ферментов, но и субстратную специфичность, сродство к субстрату, повысить устойчивость ферментов к действию высокой температурыи изменениям рН (менять оптимальные значения температуры и рН), получать чистые продукты, а ферменты использовать вторично. Изучение иммобилизированных ферментов прояснило многие детали ферментативного катализа и открыло дорогу принципиально новым подходам в исследовании ферментов. В таких системах фермент работает на границе раздела фаз, внутри так называемых «обращенных» мицелл [53, 54]. Однако пока нет полной уверенности в том, что предлагаемые модельные системы адекватны живой клетке. По крайней мере некоторый пессимизм по поводу того, что в энзимологии скоро будет нечего делать абсолютно не оправдан. Думается самое интересное еще впереди.

ЛИТЕРАТУРА

1. Овчинников Ю.А., Шамин А.Н. Строение и функции белков. – М.: Педагогика, 1983. – 128 с.
2. Наградова Н.К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков // Соровский Образовательный Журнал. – 1996. – № 7. – С. 10 – 19.
3. Шамин А.Н. Биокатализ и биокатализаторы. – М.: Наука, 1971. – 194 с.
4. Реннеберг Р. Эликсиры жизни: Новейшие результаты в области исследования ферментов. Пер. с нем. – М.: Мир, 1987. – 152 с.
5. Резенгарт В.И. Ферменты – двигатели жизни. – Л.: Наука, 1983. – 160 с.
6. Коровкин Б.Ф. Проблемы современной энзимодиагностики // Вестник АМН СССР. – 1985. – № 1. – С. 12 – 22.
7. Осинкин А.А. Жизнь и деятельность академика К. Кирхгофа / труды Ин-та истории естествознания и техники АН СССР. История химических наук. – М.: АН СССР. 1960. Т. 30. – С. 252 – 287.
8. Шамин А.Н. Основные этапы развития учения  о ферментах: В кн.: Развитие представления в области кинетики, катализа и реакционной способности. Под ред. Я.Т. Эйдуса. – М.: Наука, 1966. – С. 164 – 180.
9. Чернов Н.Н. Ферменты в клетке и пробирке // Соровский Образовательный Журнал. – 1996. – № 5. – С. 28 – 34.
10. Лагнадо Дж. Первым биохимиком была женщина? // Биохимия. – 1994. – Т. 59, вып. 1. – С. 142 – 144.
11. Ферменты / Под ред. А.Е. Браунштейна. – М.: Наука, 1964.– 314с.
12. Классификация и номенклатура ферментов. – М.: ИЛ, 1962.– 199 с.
13. Номенклатура ферментов – М.: ВИНИТИ, 1979. – 321 с.
14. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. – М.: Мир, 1966 – 814 с.
15. Ю. Амшор П. Катализ и ингибирование химических реакций.– М.: Мир, 1966. – 508 с.
16. П.Березин И.В. Исследования в области ферментативного катализа и инженерной энзимологии. – М.: Наука, 1990. – 384с.
17. Березин И.В., Клёсов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики .– М.: Изд-во МГУ, 1976. – 320 с.
18. Клёсов А.А., Березин И.В. Ферментативный катализ. Ч. 1. – М.: Изд-во МГУ, 1980 – 264 с.
19. Клёсов А.А. Ферментативный катализ. Ч .2. – М.: Изд-во МГУ, 1984. – 264 с.
20. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа – М.: ВШ, 1977 – 280 с.
21. Волькенштейн М.В. Физика ферментов. – М.: Наука, 1967. – 200 с.
22. Уолтер Ч. Кинетика ферментативных реакций. – М.: Мир, 1969. – 128 с.
23. Хайдеров А. Развитие отечественной энзимологии. – Душанбе: Дониш, 1990 – 156 с.
24. Розенгарт В.И. Ферменты – двигатели жизни.– Л.: Наука, 1983. – 160 с.
25. Кошланд Д. Катализ в живой природе и в пробирке. – В кн.: Горизонты биохимии. / Под ред. М.М. Колеса. – М.: Мир, 1964. – С. 202 – 217.
26. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии.– М.: Наука, 1974 – 256 с.
27. Гребенщиков Ю.Б., Чарвиани Г.Г., Чачечиладзе И.И. и др. Исследование активного центра миозина методом парамагнитных меток.// Биофизика. – 1971.– T. 16, № 5 – С.794 – 800.
28. Jencks W.P. The mechanism of enzyme action. – In: Current aspects of biochemical energetics. – N.Y.: Acad. Press, 1966. – P.273 – 300.
29. Eyring H., Limpy R., Spikes I.D. The mechanism of enzyme action.– N.Y.: Hopkins Press, 1954 – 540 р.
30. Волькенштейн М.В. Молекулярная биология.–М.: Наука, 1964.–350 с.
31. Karush F. Heterogeneity of the binding sites of bovine serum albumin. // J. Amer. Chem.Soc. – 1950 –Vol. 72, № 6 – P. 2705 – 2713.
32. Kim Y.D., Lumry R. Studies of the chymotripsinogen family XII "A" type substates of a-chimotrypsin at neutral and alkaline pH values. // J. Amer. Chem. Soc. – 1971. – Vol. 93, № 3 – P. 1003 – 1013.
33. Попов Е.М. Теоретическое изучение фермент-субстратных взаимодействий. // Молекулярная биология. – 1977. – T. 11, № 1. –  
    С. 5 – 41.
34. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метобализма. – М.: Мир, 1966. – 864 с.
35. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа. – М.: Наука, 1965. – 248 с.
36. Варфоломеев С.Д., Зайцев С.В. Кинетические методы в биохимических исследованиях. – М.: Изд-во МГУ, 1982. – 345 с.
37. Химическая и биологическая кинетика. / Под ред. Н.М. Эмануэля. – М.: Изд-во МГУ, 1983.– 296 с.
38. Березин И. В., Варфоломееф С.Д. Биокинетика. – М.: Наука, 1979. – С.4 – 62.
39. Киперман С.Л. От кинетической модели – к механизму каталитических процессов. – В кн.: Механизм катализа. Ч. 1. Природа каталитического действия. – Новосибирск: Наука, 1984. – С. 156 – 174.
40. Крупянко В.И. Векторный метод представления ферментативных реакций. – М.: Наука, 1990 – 144 с.
41. Фёрш Э. Структура и механизм действия ферментов. / Пер. с англ. – М.: Мир, 1980 – 432 с.
42. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир, 1990. – 350 с.
43. Gutfreund H. An introduction to – the steady of enzymes. – Oxford, 1965. – P. 86
44. Segel I.H. Enzyme kinetics – L.: Wiley, 1975. – P. 100.
45. Крупянко В.И. Система координат, удобная для анализа взаимосвязей между отдельными типами активации и ингибирования ферментов. // Прикладная биохимия и микробиология. – 1986. – Т. 22, вып. 33. – С. 440 – 446.
46. Крупянко В.И. Метод К_м , V – система координат в ферментативной кинетике. – Пущино: ОНТИ НИБИ, 1987. – 117 с.
47. Березин И.В. Иммобилизированные ферменты. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. – 220 с.
48. Березин И.В., Клячко Н.Л. Биотехнологии. – М.: Высш. шк., 1982. – 170 с.
49. Коршак В.В., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. – М.: Наука, 1984. – 261 с.
50. Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. – М.: Химия, 1986. – 296 с.
51. Иммобилизированные клетки в биотехнологии. Сб. науч. тр. – Пущино. 1987. – 175 с.
52. Иммобилизированные клетки и ферменты. Под ред. Дж. Вудворда. Пер. с англ. под ред. И.В. Березина. – М.: Мир, 1988. – 216 с.
53. Клячко Н.Л., Дулькис Ю.К. Димеризация рекомбинантной пероксидазы в системе обращенных мицелл // Биохимия. – 1997. – Т. 62, вып. 10. – C. 1319 – 1326.
54. Клячко Н.Л., Гладышева В.Н. Формиатдегидрогеназа в системе обращенных мицелл // Биохимия. – 1997. – Т. 62, вып. 12. – С. 1683 – 1687.