Цитоскелет

Занятие № 11.

Цитоскелет.

 

1. Промежуточные  филаменты (ПФ).                                                                                           

1.1. Особенности  строения эпителиальных кератинов.

Характерной чертой всех эпителиальных  клеток является присутствие кератинов. Кислые кератины включают в себя 11 эпителиальных кератинов, обозначающихся символами К9-К20, а также 4 вида кератина волос (На1-На4). Основные кератины образованы 8 эпителиальными белками, получившими название К1-К8. Молекулярная масса как тех, так и других варьирует от 40 до 67 кДа. Кислые и основные кератины образуют пары, то есть являются облигатными гетерополимерами, и относятся к группе цитоплазматических ПФ.

Кератиновые (или цитокератиновые) ПФ также принято называть тонофиламентами. Имеющиеся в литературе данные позволяют сделать вывод о том, что присутствие цитокератинов в клетке является признаком, который может быть использован для идентификации эпителия. То есть каждому виду эпителиальных клеток, характеризующемуся определенными функциями и локализацией, присущ и характерный набор и кератиновых полипептидов.

Все белки ПФ имеют схожую вторичную  структуру: правозакрученный α-спиральный стержневой домен, содержащий три коротких не-α-спиральных линкера, не-α-спиральные головной (N-конец) и хвостовой (С-конец) домены. Строение стержневого участка и линкерных сегментов цитокератинов аналогично единому плану организации белков ПФ, однако головной и хвостовой домены выявляют ряд отличий. Так в состав головного сегмента кератинов I типа входят домены Е1, V1 и H1, а в состав хвостовой области – домены Е2 и V2; для С-конца кератинов II типа кроме выше описанных доменов характерен также домен Н2. Следует заметить, что субдомены E1 и V1  в кератинах являются наиболее основными и богатыми серин-глициновыми остатками.

 

1.2. Функции  эпителиальных промежуточных филаментов.

В современной науке существует два  направления в определении  приоритетной функции ПФ. Первое - механистическое  направление, сторонники которого утверждают, что основная функция ПФ (наряду с эластическими элементами) – устойчивость к деформации, механическая прочность. Представители же немеханистических взглядов считают, что первичная функция ПФ – регуляторная. То есть ПФ могут служить переносчиками информации от ядра к плазматической мембране и в обратном направлении. Возможно, что с их участием также происходит регуляция клеточного движения и специфического распространения органелл, везикул и мембранных доменов.

Кроме того, в клетке выявлена связь  ПФ с десмосомами и внеклеточным матриксом (через гемидесмосомы). Формирование кератиновых филаментов и контактов играет значительную роль в интегративном морфогенетическом движении в течение эмбриогенеза. У мышей формирование десмосомальных контактов предшествует образованию ПФ. Следует заметить, что при разрушении десмоплакина (один из белков десмосомы) происходит реорганизация сети, образуемой кератинами 8 и 18.

Предполагается также, что белки, ассоциированные с микротрубочками, способствуют формированию связи между  микротрубочками и ПФ. Так плектин – белок, объединяющий ПФ в клетках культуры фибробластов, также имеет сайты связывания ПФ с микротрубочками и микрофиламентами.

 

1.3. Формирование  промежуточных филаментов.

 Образование  цитоплазматической сети.

Первым этапом при формировании ПФ является образование двумя пептидными цепями  единой левой суперспирали. Такая укладка является параллельной, так как С-концы обоих полипептидов расположены по одну сторону от стержневого домена. Подобное взаимодействие с образованием димеров называется также ''скрученной спиралью'' (coiled coil). Это одно из самых сильных взаимодействий белкового мира.

Образовавшиеся димеры ассоциируют  антипараллельно и формируют  таким образом тетрамеры, или протофиламенты.  В настоящее время выделяют два типа взаимодействий между димерами на этом уровне структурной организации ПФ: продольное и боковое. На следующем этапе два протофиламента, соединяясь, образуют протофибриллу. Данные сканирующей электронной микроскопии показывают, что в состав 10-нм промежуточного филамента входит 4 протофибриллы, то есть 8 протофиламентов, или 32 исходных полипептида. Однако, в зависимости от типа ПФ и условий, в которых происходит полимеризация, в состав ПФ могут входить от 2 до 6 протофибрилл.

В клетке промежуточные филаменты  ассоциированы с двумя типами мембран: цитоплазматической и мембранами  ядерной оболочки. Исследования in vitro показывают, что для формирования ПФ de novo ядерного окружения не требуется. Было замечено, что околоядерная область не является обязательным местом формирования ПФ: ряд экспериментов подтверждает периферийную первичную локализацию ПФ. Расположение ПФ в перинуклеарной области в данном случае, вероятно, связано с транспортом новосинтезированных ПФ в эту зону. 

Подобные отношения между ядерной  областью и цитоплазматической мембраной обеспечивают пространственную организацию цитоплазмы, коммуникативную и, возможно, информационную,  связь внутри клетки. Таким образом, сеть ПФ представляет собой вариабельную цитоплазматическую инфраструктуру, которая характеризуется следующими видами взаимодействий:

― взаимодействия с системой плазматическая мембрана - внеклеточный матрикс,

― взаимодействия с другими компонентами цитоскелета,

― взаимодействия с системой ядерная  оболочка – ядерный матрикс.

 

1.4. Динамика и регуляция работы кератинов.

Связь с клеточным  циклом.

Вариабельное поведение ПФ в  течение клеточного цикла говорит  о наличии системы тонкой регуляции  их работы. Так,  в период после  их синтеза промежуточные филаменты  подвергаются ацетилированию, фосфорилированию, гликозилированию, действию Са²⁺-зависимых протеаз, а также трансглютаминаз. О возможных эффектах гликозилирования на структуру, объединение и динамику ПФ на данный момент известно не очень много. Так, например, показано, что цитокератины человека (в клетках культуры HT29 – культура раковых клеток толстой кишки человека) К8 и К18 имеют О-гликозидные связи на N-ацетилглюкозаминных остатках; это повышает растворимость белков ПФ. Таким образом, процессы фосфорилирования и гликозилирования играют важную роль в динамике ПФ и в клеточном цикле.

Если же рассматривать динамику формирования ПФ в эмбриональном  развитии, то можно заметить, что  первыми по времени появляются цитокератины (они обнаруживаются уже в зиготе) и только на стадии закладки третьего зародышевого листка (мезодермы) начинает экспрессироваться другой тип ПФ - виментин. Образование филаментов остальных видов связано с дальнейшими процессами дифференциации тканей.

 

1.5. Кератиновые  болезни.

Мутации генов, ответственных за синтез белков ПФ, приводят к возникновению различных заболеваний. Следует заметить, что большая часть подобных изменений обусловлена мутациями в генах, продуктами которых являются кератины. По этой причине среди генетических заболеваний этого класса наиболее распространены кожные.  Около половины всех кератиновых мутаций идентифицируется в десятой части аминокислотных остатков спирали А1  I типа белков ПФ. Таким образом, возникновение мутаций в генах, ответственных за синтез белков ПФ, приводит к тому, что кератиновые молекулы не способны быстро димеризоваться. Вследствие этого взаимодействие между субъединицами нарушается, что делает сеть ПФ более рыхлой и менее устойчивой к деформации.

 

1.6. Особенности  строения и функций кератинов  8 и 18.

При помощи электронно-микроскопических и иммуноцитохимических исследований было доказано, что кератины 8 и 18 являются основными для двух основных типов клеток печени: гепатоцитов и клеток желчных канальцев.  В клетке тонофиламенты наиболее распространены на периферии гепатоцита, где они связываются с десмосомами. В меньшем количестве кератиновые филаменты обнаружены   в области ядра и аппарата Гольджи. Однако, при этом ПФ центральной части клетки упакованы в пучки более плотно по сравнению с филаментами периферии. Существование в небольших количествах прекератина как в гепатоцитах, так и в клетках желчных протоков, позволяет предположить важную роль процессов кератинизации в клетках печени. Таким образом, кератины 8 и 18 принимают непосредственное участие в процессах структурной интеграции гепатоцитов.

Кератин 8 и кератин 18  –   названия, закрепленные за белками ПФ человека; у мышей они называются Endo A и Endo B соответственно (Kulesh & Oshima, 1989). Как уже говорилось, кератины – облигатные гетерополимеры. Так, кератины типа I  К18 и К19 не могут формировать филаменты без кератинов типа II – К8. Было замечено, что в отсутствие К8, К18 не образуется в паренхиме печени (Baribault et al, 1993).

Все гены кератинов объединены в  два кластера, расположенные на  хромосоме 12 (кератины типа II и кератин 18) и на хромосоме 17 (тип I). Интересно, что 87% неактивных генов кератинов родственны генам кератинов 8 и 18.   В состав гена К18 входит 7 экзонов и 3791 пар оснований. Кератины 8, 18 и 19, а также виментин – это первые ПФ, которые формируются в раннем эмбриональном развитии. В частности, экспрессия К8 и К18 разделяет стадию бластоцисты на трофэктодерму и внешнюю эндодерму эмбриона.

На клетках культуры HT29 было оказано, что О-гликозилирование N-ацетилглюкозаминных остатков в молекулах кератинов 8 и 18 увеличивает растворимость этих белков. Аналогичный эффект вызывает гиперфосфорилирование этих кератинов. Присутствие гиперфосфорилированной формы кератина 8 (НК8)  является физиологическим маркером и вступления  клетки в митоз, и воздействующего на нее стресса.

Изменения организации  кератиновых ПФ в гепатоцитах, например, при длительной интоксикации организма, также приводят к формированию кератин - содержащих агрегатов ― телец  Маллори.  Следует заметить, что  и в данном случае тельца Маллори  включают в себя преимущественно кератин 8  и вариабельное количество кератина 18, объединенных нефиламентным способом. Тельца Маллори содержат филаменты длиной от 14 до 20 нм – это так называемые прекератинподобные структуры.

 

1.7. Кератины 8/18, апоптоз, клеточный цикл, протоонкогены.

Инициация апоптоза в эпителиальных  клетках приводит к реорганизации  кератинового цитоскелета в дискретные гранулы. Этот процесс по времени  предшествует морфологическому разрушению ядер. Первичные изменения структуры  ПФ связаны с фосфорилированием кератина 18 по серину-53. В дальнейшем происходит активация каспаз и специфическое расщепление консервативной  не-α-спиральной линкерной области (L1-2)  с их участием. Деградации кератина  8 при активации апоптоза не происходит. Таким образом, разрушение К18 может отражать основную модель инициации ПФ в течение апоптоза (Caulin et al,1997). Клетки, в которых отсутствуют кератины 8 и 18, являются более чувствительными к TNF-индуцированному апоптозу.

Первый интрон гена К18 обладает тканевой неспецифичной энхансерной активностью. В его состав входит консервативный АР-1-сайт, способный связываться с факторами транскрипции, в частности с продуктами генов c-jun и с c-fos. Так трансфецирование гена c-fos в клетках F9 приводит к появлению частично дифференцированных клеток, которые начинают экспрессировать К8 (и, соответственно, К18). На основании этих данных можно сделать вывод, что низкий уровень протоонкогенов, по крайней мере, частично, лимитирует экспрессию гена К18 в недиференцированных клетках культуры и, по аналогии с ними, в ранних эмбриональных клетках.

Исследования генов Ras и Raf привели к аналогичным результатам. Продукты генов Ras и Raf связываются с сайтами AP-1 и Ets в первом интроне гена К18 и увеличивают экспрессию этого гена. Активация экспрессии гена К18 является функционально значимой, так как уровень синтеза К18 коррелирует с увеличением инвазивной способности клеток. Таким образом, нерегулируемая экспрессия генов К8 и К18 может приводить к формированию метастаз опухолевыми клетками.

Кроме того, в настоящее время  известно, что Mrj-Hsp/c70 – белок, принадлежащий к семейству шаперонов, непосредственно связывается с основным кератином К18, регулируя таким образом взаимодействие между К8 и К18. Возможно, это один из механизмов формирования телец Маллори.

 

 

2. Микрофиламенты.

2.1. Актин.

Глобулярный актин - это  белок с молекулярной массой 42 кДа, состоящий из одной полипептидной  цепи. Аминокислотная последовательность актина скелетных и сердечных мышц включает 375 аминокислотных остатков, в том числе один остаток необычной аминокислоты - 3-метилгистидина, который образуется посттрансляционно. N-концевая аминокислота ацетилирована. Молекула актина содержит 5 остатков цистеина (Cys-10, -217, - 257, -285 и -374). Актин гладкой мускулатуры содержит еще один остаток цистеина в положении 17. Немышечные актины содержат два дополнительных цистеиновых остатка - Cys-17 и Cys-272. Однако Cys-10 в этих актинах заменен на Val-10, и общее количество цистеиновых остатков равно 6. Только один из этих остатков, Cys- 374, экспонируется на поверхности молекулы интактного G-актина, содержащего АТР. Доступность других остатков цистеина определяется степенью нативности молекулы и видом нуклеотида. В растворе с высокой концентрацией АДР кроме Cys-374 доступным для SH-реагентов становится еще один остаток цистеина, по-видимому, Cys-10.

При анализе аминокислотной последовательности актина обращает на себя внимание большое  количество отрицательно заряженных групп, особенно на N-конце цепи. Так, из пяти N- концевых аминокислотных остатков четыре содержат в боковых цепях карбоксильные группы, а среди первых 25 аминокислотных остатков отрицательно заряжены 7.

Полипептидная цепь актина гладкой мускулатуры и немышечных сократительных систем содержит 374 аминокислотных остатка. Различия в аминокислотных последовательностях невелики и в основном консервативны. Цитоплазматические актины отличаются от актина скелетных мышц позвоночных только 25 заменами. При этом существенно, что участок полипептидной цепи, включающий остатки 18 - 75, стабилен, в то время как участки 2 - 18 и 259 - 298 содержат много замен. Высокая консервативность первичной структуры актина, по-видимому, является следствием его высокой функциональной активности, требующей сохранения центров взаимодействия как с другими молекулами актина, так и с актинсвязывающими белками .