Тонкослойная хроматография

элюирования позволяет повысить селективность  разделения за счет

 

изменения элюирующей способности подвижной фазы. Однако во всех указанных способах не удается исправить существенный недостаток ТСХ - низкую эффективность разделения, поскольку движение элюента осуществляется за счет капиллярных сил. Вариант планарной хроматографии с принудительным движением элюента (под давлением) позволяет существенно улучшить эффективность разделения. Это наглядно подтверждает пример разделения лекарственных веществ на адсорбенте - силикагель 60 при элюировании смесью н-бутанол- хлороформ-метилэтилкетон-уксусная кислота (25 : 17 : 8 : 6), показанный на рис. 2.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 2. Хроматограмма смеси: 1 - стрихнин; 2 - эфедрин; 3 - метамфетамин; 4 - фенметразин; 5 - метил- фенидат; 6 - амфетамин; 7 - дезопинон; 8 - корамин; 9 - кофеин; S - старта - под давлением, б - при использовании обычной тонкослойной хроматографии.

Идентификация компонентов. После разделения веществ необходимо обнаружить их на хроматограмме. Для обнаружения бесцветных веществ, в первую очередь, следует воспользоваться физическими методами, основанными на поглощении света и флуоресценции. Для обнаружения веществ, поглощающих в УФ-областиспектра, часто применяют пластинки со слоем сорбента, содержащим флуоресцирующее вещество или опрыскивают хроматограмму после разделения смеси раствором флуоресцирующего вещества. При облучении пластинки УФ-излучением вещества, поглощающие в этой области спектра, обнаруживаются в виде темных зон (пятен). Флуоресцировать в УФ-свете способно значительное количество веществ, полученные пятна имеют при этом различный оттенок. Для обнаружения флуоресцирующих веществ или веществ, поглощающих в УФ-области спектра, используют источники света с максимумами излучения в области 254 и 365 мкм. Помимо оптических методов обнаружения веществ, применяют химические методы проявления хроматограмм. К химическим методам относится использование «универсальных реагентов» и реагентов, избирательно реагирующих с определенными функциональными группами определяемых соединений.

4. Количественный анализ

Для количественной оценки содержания вещества в хроматографических зонах используют различные методы:

 Определение с удалением хроматографической зоны с пластинки можно проводить двояким образом: переносом хроматографической зоны вместе с сорбентом либо экстрагированием хроматографической зоны со слоя сорбента.

Определение соединений непосредственно на пластинке методом визуального сравнения размеров площадей пятен и их окраски с соответствующими параметрами пятен стандартных образцов

Метод денситометрии, повышающий точность результатов определения, основан на сканировании хроматограмм в видимом и УФ- свете с помощью «хроматографических спектрофотометров» - денситометров.

Денситометры позволяют измерять поглощение света веществом на хроматограмме в режиме пропускания или отражения, а также флуоресценцию и ее тушение. Режим пропускания доступен, если только исследуемое вещество имеет полосу поглощения в видимой области спектра. В УФ-области регистрацию в режиме пропускания осуществить нельзя из-за собственного поглощения силикагеля и подложки хроматограммы.

Метод видеоденситометрии - сравнительно новый метод для количественной обработки хроматограмм. Принцип метода заключается во введении изображения хроматограммы в компьютер с помощью видеокамеры или цифровой камеры с последующим сравнением интенсивностей пятен стандартных и определяемых соединений. Видеоденситометр включает осветительный блок, видеокамеру с платой видеоввода или сканер, персональный компьютер с установленной операционной системой Windows и соответствующим программным обеспечением.

Программа обработки хроматографических данных позволяет выполнять следующие функции: вводить изображения хроматограмм и сохранять их с высоким качеством и разрешением; выделять на введенном изображении хроматограммы рабочий участок, на котором будет производиться дальнейшая обработка изображения; производить автоматический или ручной поиск пятен; проводить обработку пятен, переводить их в форму хроматографических пиков, рассчитывать значения R_f и площади пиков; измерять содержание вещества в анализируемых пятнах (в относительных единицах); вводить значения концентраций для построения градуировочных зависимостей: линейной интерполяцией; линейной аппроксимацией более чем , через две точки; квадратичной интерполяцией; автоматически вычислять содержание вещества в анализируемых пятнах по введенным калибровочным значениям; представлять результаты в виде печатных документов.

Количественную обработку пятна  в видеоденситометрии проводят по двум характеристикам: по площади пятна и его «объему» в

 

Рис. 3. Вид пространственного распределения яркости в области пятна: А_i,j - значение уровня яркости точки пятна; В_i,j - значение уровня яркости точки на базовой поверхности.

пространстве, при этом в качестве третьей координаты используют яркость (интенсивность окраски пятна) ( рис. 3).

Денситометрия с планшетным сканером с программным обеспечением для обработки хроматограмм практически не отличающимся от стандартных программ, применяемых для видеоденситометров, но существенно меньшей стоимости. При этом сканирование дает более четкое изображение хроматографических зон, что можно объяснить пониженным влиянием неравномерности освещения анализируемых объектов, чем в случае видеоденситометра (рис. 4).

 

 

Рис. 4. Хроматограммы, полученные при разделении красителей

азорубина (1) и амаранта (2) с применением системы ввода изображения с помощью видеоденситометра «ДенСкан-2» (слева) и планшетного сканера «Mustek Scan Express» (справа): а - полутоновое изображение рабочей области; б - денситограммы; в - 3Б-изображение рабочей области; г - 3Б-изображение области разделения пиков.

 

6. Применение для решения практических задач

 Применение ТСХ особенно  эффективно для предварительного  разделения (по классам, группам,  видам веществ) компонентов сложных  смесей органических загрязнителей  воды, почвы и воздуха. Индивидуальная  идентификация с помощью одной лишь ТСХ затруднена из-за отсутствия выокочувствительных и селективных детекторов, кроме того, определение целевых компонентов менее точно, чем в случае ГХ и ВЭЖХ. Часто ТСХ применяют на первом этапе анализа для разделения сложных и многокомпонентных смесей органических соединений на отдельные более простые группы, и уж потом проводят более детальное исследование этих групп «более тонкими» методами (ГХ, ВЭЖХ, ЯМР, ИК или масс-спектрометрией).

Использование ТСХ при анализе  загрязненной пресной и морской  воды открывает широкие возможности  для препаративного разделения, предшествующего другим методам, разделения искомых примесей и дополнительной идентификации. ТСХ используют для обнаружения и полуколичественного определения веществ разной природы: поверхностно-активных веществ, углеводородов, ПАУ, фенолов, пестицидов.

Для определения неионных ПАВ в сточных и речных водах используют пластинки со слоем силикагеля или Кизельгеля G. На пластинку наносят хлороформенный экстракт ПАВ и разделяют их при использовании в качестве подвижной фазы смесей этилацетат : вода : уксусная кислота. Обнаруживают пятна при опрыскивании смесью: реактив Бургера : фосфорная кислота : этанол : 5% раствор BaCl₂.2H₂O (10:1:10:5). ПАВ проявляют в виде розовых пятен. Метод позволяет определить в воде от 0,1 до 1,0 мг/л неионогенных ПАВ. Из сточных вод в этих условиях экстрагируются ионные ПАВ, но они движутся вместе с фронтом растворителя и не проявляются.

Предложено много методик определения  фенолов. Хлорфенолы разделяют на пластинках с оксидом алюминия при многократном элюировании бензолом или на силикагелевых пластинках при элюировании смесью бензола и петролейного эфира (1:1). Определяют фенолы проявлением 2% раствором 4-аминоантипирина (предел обнаружения 0,5 мкг/л) или по флуоресценции при 254 нм (до 0,5 мкг фенолов). Второй вариант определения фенолов - разделение в виде: антипириновых, 4-аминоантипириновых производных или с п -нитрофенилазокрасителями.

Часто ТСХ определяют в водах  пестициды: хлорфеноксиуксусные кислоты, хлорсодержащие пестициды, триазиновые гербициды, гербициды на основе мочевины, карбаматы и фенилмочевины и фосфорорганические пестициды. Примеры и условия определения пестицидов в водах представлены на рис. 5 и в табл.4.

Рис. 5. Хроматограмма разделения гербицидов (зоны сверху вниз): 1 - прометон, атразин, промазин; 2 - симетрин, пропазин, прометрин; 3 - атратон, симазин, прометрин; 4 - атратон, десметрин, атразин, прометрин; 5 - атратон, симетрин, атразин, промазин; 6 - атратон, десметрин, промазин; 7 - симазин, атразин, промазин; 8 - атратон, прометон, прометрин.

 

ТСХ является недорогим и эффективным  методом разделения, идентификации  и полуколичественного определения  пестицидов в почвах. В качестве примера можно привести метод  определения альдрина и гептахлора на пластинках с оксидом алюминия; для их элюирования используют смесь изооктана и пиридина (7:3) или изооктана и диэтилового эфира (7:3). Для обнаружения пестициды опрыскивают реагентом Митчела с последующим облучением УФ-излучением. Еще одним примером служит определение фосфорорганических пестицидов на пластинке со слоем силикагеля G фирмы Merck. В качестве подвижных фаз используют смеси: этилацетат : этанол : раствор аммиака (80:15:5); толуол : уксусная кислота : вода (60:60:6); бензол : этанол (9:1); этанол : этилацетат : уксусная кислота (3:4:2); бензол : хлороформ : этилацетат : пропанол (4:2:4:2). Для обнаружения фосфорорганических пестицидов предложено несколько проявляющих реагентов: раствор 4-(и-нитробензил)пиридина для обнаружения инсектицидов; смесь растворов нитрата серебра и бромкрезолового синего в метаноле - для проявления пятен пестицидов, содержащих тиофосфорильные группы. Для обнаружения Р=О-группы используют метод ингибирования фермента холинэстеразы, пестициды обнаруживаютя в виде белых пятен на голубом фоне. В реальных образцах почвы могут присутствовать смеси пестицидов различной природы и их состав обычно неизвестен. ТСХ, оснащенный современными денситометрами, помогает решить эту сложную проблему. Денситометр позволяет сканировать полученные хроматограммы одновременно при нескольких длинах волн. Сочетание этой возможности с легкостью и экспрессностью варьирования природы сорбента на пластинке и состава элюента позволяет за короткое время получить большой объем информации и дать предварительную оценку загрязнения образцов почвы. Пример такого определения показан на рис. 35. Полученные результаты можно далее уточнить с использованием ВЭЖХ, ГХ или ГХ-МС.

В органических почвенных вытяжках определяют также ПАУ, разделяя их на силикагеле или целлюлозе, идентификацию  проводят флуоресцентным методом.

Таблица 3. Примеры определения пестицидов в водах тонкослойной хроматографией

Разделяемые пестициды	Адсорбенты	Элюенты	Проявитель	смин, мкг
Хлорсодержащие пестициды: дильдрин, ДДТ линдан, гептахлорэпоксид, альдрид, гептахлор	Силикагель	CCI4	Родамин Б
12 пестицидов: эндрин, хлордан, гептахлор, нонахлор, изодрин, альдрин, гептахлор- борнен, гептахлорциклопентадиен, и др.	«	СС14-гексан (2:8)	«	-
Триазиновые гербициды: атранон, атразин, прометон, прометин, пропазин, симазин, симетрин	Силикагель G	Хлороформ-ацетон (9:1)	0,5% Раствор бриллиантового зеленого в ацетоне/Вг2
Гербициды на основе мочевины: линурон, монурон, диурон, небурон, фенурон Карбаматы и фенилмочевины: ИКФ, хлор- ИКФ, фенурон, линурон, байгон, пиролан, диметолан, метасил, изолан, мезурол Фосфорсодержащие пестициды: бромофос, дибром, этион, диазинон, мекарбам и другие	Силикагель « Силикагель G	Метан- 2,2’,4триметилпентан- метилхлороформ (5:60:35) Бензол; бензол-ацетон (95:5); циклогексан-этанол (85:15) гексан- ацетон (70:30) Гексан-ацетон (5:1), хлороформ - ацетон (9:1) и хлороформ - уксусная кислота (9:1) последовательное элюирование	Нингидрин/бутанол/ уксусная кислота п-Диметил-аминобензаль- дегид (карбаматы); NaNO2 /а-нафтол (мочевины) HI/(NH4)2MoO4/SnCl2/NH3	0,2 4-5 2-5 1 мкг/л
Феноксиуксусные кислоты: 2,4-Д, 2,4,5- трихлорфенокси уксусная, 4-хлор-2-метил- феноксиуксусная, 2,2’-дихлорпропионовая	Кизельгель G Силикагель G	Циклогексан-бензол-гексан- уксусная кислота (14:3:1:2)	AgNO3/2-феноксиэтанол

Рис. 6. Денситограмма ТСХ-хроматограммы питьевой воды с добавкой гербицидов (20 нг в пробе):1 - метоксурон; 2 - монурон; 3 - хлортолурон; 4 - небурон; 5 - линурон при различных длинах волн (200; 220; 240; 260; 280; 300 нм).

Для определения загрязнителей  в воздухе его предварительно аспирируют через различные фильтры, уловленные вещества экстрагируют подходящим растворителем, и полученный экстракт анализируют ТСХ. ТСХ позволяет определять в воздухе ароматические углеводороды, ароматические карбонильные соединения, ароматические амины и имины, фенолы, металлорганические соединения, сложные эфиры фталевой кислоты. Сканирование хроматограмм с использованием спектроскопических методов, особенно флуоресценции, позволяет идентифицировать весь спектр токсичных соединений.