Ионообменная хроматография в фармацевтическом анализе

При изменении  ионной формы смолы или в присутствии  органических растворителей, таких, как  ацетонитрил, ТГФ, может изменяться и объем смолы. Если смола уменьшается  в объеме, упаковка в колонке оседает  и образуется мертвый объем наверху  колонки. Это оседание сопровождается потерей эффективности. Если смола  набухает и упаковка в колонке  увеличивается, то возрастает сопротивление  в колонке, что значительно уменьшает  скорость потока и может даже привести к разрушению сорбента. Невысокая стабильность ионогенных материалов является одним из недостатков ионообменной хроматографии, причем анионообменники менее стабильны, чем катионообменники. Для увеличения срока службы колонок используют предколонки, а также регенерацию колонок сильным растворителем. Катиониты, например, регенерируют, обрабатывая 1 М азотной кислотой и продолжительно промывая той подвижной фазой, которая будет использована.

Ионообменники характеризуются степенью набухания  и емкостью. Степенью набухания называют объем упакованного в колонну  обменника (в мл), приходящийся на 1 г его в сухом виде, и имеет размерность мл/г. Максимальное количество ионов, которое может связать ионообменник, определяет его обменная емкость, которая совпадает с концентрацией ионогенных групп. Ёмкость выражается числам ммоль эквивалентов обмениваемого иона на 1 г сухого обменника (моль*экв/г) или на 1 мл упакованного в колонну набухшего ионообменника (ммоль экв/мл) при значениях рН, соответствующих его полной ионизации. Для высокомолекулярных ионов или амфолитов, например белков, вводят понятие "эффективная" обменная емкость, которая зависит от размера молекулы амфолита, расстояния между ионогенными группами и степени доступности всего объема пористой матрицы обменника для этих молекул. Понятия емкости и эффективной емкости могут не совпадать. Иногда приходится снижать полезную емкость сорбента за счет изменения рН, увеличивая при этом его эффективную емкость. Катионообменные смолы имеют емкость около 4,4 ммоль*экв/г, а анионообменные - 3,5-4 ммоль*экв/г для гелеобразной структуры и 2,5 ммоль*экв/г для пористой. Обменная емкость изменяется при изменении рН. При низких рН происходит нейтрализация катионита при добавлении протона:

R^- + Н⁺ ↔ R^-H⁺,

а при  высоких рН подобным образом при  действии щелочи нейтрализуются аниониты:

R⁺ + OН^- ↔ R⁺OH^-.

Ионообменная  емкость сильных катионитов примерно постоянна в диапазоне рН=2-11, но падает до нуля при низких рН, поэтому  они не могут быть использованы при  рН<1. Сильные аниониты должны применяться  при рН<11, слабые катиониты при  рН>6, а слабые аниониты при рН<8. Сильные ионообменники могут  быть использованы в более широком  диапазоне рН, чем слабые. Этим объясняется  широкое применение сильных ионитов, на которых может быть разделено  большее количество веществ разных классов одновременно, особенно если применяют градиентное изменение  рН. Прочно удерживаемые вещества, нестойкие  при крайних значениях рН, целесообразно  разделять на слабых ионитах. В отличие  от сильных ионитов полностью ионизированых при рН=2-11, слабые иониты полностью ионизированы в ограниченной области рН, и их ионизацией можно управлять, варьируя рН элюента в пределах диапазона рабочих значений рН.

Подвижная фаза в ионообменной хроматографии  должна обеспечивать растворимость  различных солей и иметь свойства буферного раствора, необходимые  для ионного обмена, контроля степени  удерживания компонентов пробы  и получения достаточной селективности  разделения.

Иногда  в подвижную фазу (водные буферные растворы) добавляют небольшое количество смешивающихся с водой органических растворителей - метанола, этанола, ацетонитрила, ТГФ. Сила и селективность растворителя зависят от типа и концентрации буферных ионов и других солей, от значения рН и от вида и концентрации добавленных  органических растворителей.

Удерживание в ионообменной хроматографии лимитируется двумя процессами: распределением компонента пробы между водной подвижной  фазой и органической неподвижной  и образованием ионных пар (т.е. анионного  или катионного обмена), причем последний  процесс является доминирующим.

Распределение вещества между фазами зависит от силы электростатического взаимодействия заряженных ионизированных групп вещества с заряженными группами ионообменника. Некоторые гидрофобные соединения или вещества, способные образовывать водородные связи, могут неспецифическим  образом взаимодействовать с  материалом матрицы.

Степень удерживания образца снижается  с увеличением ионной силы подвижной  фазы и увеличивается с увеличением  ионообменной емкости сорбента. Ионная сила подвижной фазы возрастает при  возрастании концентрации буфера и сохранении неизменным рН или при добавлении соли. Важна также концентрация буферных растворов, так как в растворе наблюдается конкуренция между ионами образца и буфера. Уменьшение концентрации буферного раствора увеличивает сродство смолы к образцу, что приводит к увеличению времени удерживания. Концентрация буферного раствора колеблется от 0.001 до 6 моль/л, причем верхняя граница определяется растворимостью соли, используемой в качестве буфера, а нижняя - самой буферной силой, так как в слабом буферном растворе нельзя контролировать уровень рН. Сильных буферных растворов также следует избегать из-за вероятности выпадения осадка и закупоривания колонок. Сила растворителя зависит от типа противоиона, причем степень удерживания образца увеличивается в ряду, обратном лиотропным сериям активности ионов, приведенным выше.

При анализе  рН раствора выбирают таким образом, чтобы молекула сорбата была полностью  ионизирована. Изменение рН подвижной  фазы влияет на удерживание ионизированного  сорбата - с повышением рН времена  удерживания увеличиваются при  анионообменном разделении и уменьшаются  при катионообменном, т.е. происходит уменьшение силы растворителя при анионном и увеличение при катионном обмене. Наиболее заметно влияние градиента  рН раствора вблизи значений рКaхроматографируемого  образца.

Чаще  всего в ионообменной хроматографии  применяют следующие буферные растворы: ацетатный, фосфатный, цитратный, формиатный, аммиачный и боратный. Селективность  разделения в ионообменной хроматографии  зависит от концентрации и вида буферных ионов и органических растворителей, а также от рН среды. Ионообменное разделение можно проводить при  повышенных температурах (40-60°С). Чем  выше температура, тем меньше вязкость подвижной фазы. С другой стороны, более высокие температуры снижают стабильность колонки. Биохимические пробы для сохранения нативных структур и биологической активности принято разделять при низких температурах (4 - 20°С).

Добавка в подвижную фазу смешивающихся  с водой органических растворителей (метанол, этанол, ацетонитрил, диоксан) действует аналогично добавке этих растворителей в ОФХ: элюирующая сила растет, удерживания образца  снижается. Эффект более выражен  для менее полярных растворителей. Добавлением органических растворителей  можно добиться также изменения  селективности хроматографической системы.

Таким образом, уменьшить времена удерживания  в ионообменной хроматографии позволяют  следующие факторы: 1) повышение температуры; 2) повышение концентрации буферного  раствора; 3) снижение степени ионизации  вещества за счет изменения рН.

В хроматографии  биохимических смесей используют модифицированные целлюлозы - карбоксиметилцеллюлоза (слабокислотные свойства), диэтиламиноэтилцеллюлоза (среднеосновные свойства, а также  гидрофильные гели декстрана (сефадексы). На их основе выпускают иониты с  карбоксиметильными, диэтиламиноэтильными, сульфоэтильными, сульфопропильными  и четвертичными основными группами (CM-, DEAE-, SE-, SP- и QAE-сефадексы). Декстрановые иониты подобны макропористым ионообменным смолам. Как и целлюлозные иониты они характеризуются высокой  гидрофильностью, что важно при  работе с биополимерами. Они так  же, как и ионобменные смолы  изготавливаются в форме шариков. Однако поры декстрановых гелей больше по диаметру, в них могут проникать  макромолекулы, поэтому такие иониты широко применяются главным образом  в гель-хроматографии, где ионообменный механизм удерживания имеет второстепенное значение при разделении биополимеров. Аналогичное применение имеют иониты на основе производных агарозы. Например, матрица агарозы связывается с аминокислотами для получения биполярных ионитов, которые селективно реагируют с биополимерами.

Сорбенты для ионообменной хроматографии  получают так же путем ковалентной  прививки к силикагелю ионогенных групп. Ионообменные силикагели не набухают, не сжимаются, как смолы, и отличаются от них большим размером и доступностью внутренних пор как для ионов  образца, так и для противоионов. Благодаря этому быстрее устанавливается  массоперенос даже без повышения  температуры и значительно возрастает эффективность сорбента. Они характеризуются  высокой термической устойчивостью  и выдерживают различные виды стерилизации. Однако, применение сорбентов  на основе силикагеля в ионообменной хроматографии огра¬ничено рабочим  диапазоном рН, в большинстве случаев  верхняя граница которого не должна превышать значений равных 6-7. Хроматограмма ионов переходных металлов, полученная на колонке Диасорб-130-ИДК, 4x250 мм[1,4,7.8].

3. Селективность ионного обмена и факторы его определяющие.

Детекторы для ионообменного хроматографического  разделения обеспечивают непрерывную  регистрацию концентрации анализируемых  ионов в элюате в присутствии  ионов элюента. Конструкция автоматической детектирующей системы иногда бывает довольно сложной.

Очень важно  правильно выбрать тип элюента, его концентрацию и величину рН, необходимые для ионообменного  разделения. Не менее важно, чтобы  детектор был согласован как с  элюентом, так и с анализируемыми ионами, т. е. он должен реагировать  на анализируемые ионы, но не на ионы элюента. Зная принцип работы детектора, можно наиболее полно реализовать  потенциальные возможности ионохроматографической системы.

В ионной хроматографии широко используется кондуктометрическое детектирование, и потому на этот тип устройств  обращается основное внимание. Для  регистрации ионообменного разделения пригодны также спектрофотометрический и электрохимический детекторы[1,4,7.8].

Для автоматического  детектирования ионов при ионообменном разделении применяют разнообразные  устройства. Детекторы можно разделить  на универсальные и селективные. Универсальные детекторы реагируют на все ионы, находящиеся в детектирующей ячейке.

Одним из примеров универсального детектора  является кондуктометрический, поскольку  все ионы, находящиеся в растворе, проводят электрический ток. Спектрофотометрический, электрохимический, пламенно-эмиссионный  и атомно-абсорбционный детекторы  являются селективными, поскольку они  реагируют только на определенные ионы. Спектрофотометрические детекторы  можно сделать почти универсальными, если после колонки осуществлять реакцию анализируемых ионов  с определенными цветообразующими реагентами.

Элюенты в ионообменной хроматографии всегда содержат ионы. С этим постоянным ионным фоном необходимо считаться в  любой детектирующей системе. В  системах с универсальным детектором необходимо переводить анализируемые  и элюирующие ионы в частицы, вызывающие разную реакцию детектора, либо подбирать  элюент, заранее обладающий этим свойством. Обычно фоновый сигнал элюента слабее, чем полезный сигнал. В большинстве  методов, используемых в анионной хроматографии, реализуется именно этот случай. Однако разработаны и системы, в которых  фоновый сигнал выше, чем сигнал образца. Селективные детекторы  удобнее в работе, поскольку можно  подобрать раствор элюента, ионы которого не будут давать сигнала, и  программировать его силу для  улучшения разделения. Возможности  селективных детекторов меньше, чем  универсальных, поскольку первые реагируют  на ограниченное число анализируемых  ионов; однако их способность регистрировать сигнал требуемого иона в присутствии  многих других может быть очень ценной.

Детекторы электропроводности пригодны для обнаружения самых разнообразных  ионов. Такие детекторы реагируют  на вещества, находящиеся в молекулярном состоянии, например воду, этанол или  недиссоциированные молекулы слабых кислот. Это важное обстоятельство нужно  учитывать при создании кондуктометрической  ионохроматографической системы. Ионохроматографический детектор должен реагировать на анализируемые  ионы иначе, чем на ионы элюента. При кондуктометрическом детектировании элюат можно обработать во второй колонке, чтобы ослабить электропроводность элюента и усилить электропроводность анализируемого образца. Можно подобрать и такой элюент, на ионы которого детектор реагирует иначе, чем на ионы образца[1,4,7.8].

1. Принцип работы ячейки.

Если  к двум электродам, находящимся в  растворе электролита, приложено электрическое  напряжение, то анионы в растворе будут  двигаться к аноду, а катионы  к катоду. Число ионов и скорость их движения в объеме электролита  определяют электропроводность раствора. Подвижность ионов (их скорость, деленная на напряженность электрического поля) зависит от заряда и размера иона, температуры, типа среды и концентрации ионов. Скорость движения ионов зависит  от величины приложенного напряжения. Напряжение может быть постоянным либо переменным синусоидальной или прямоугольной  импульсной формы.

Ток в  ячейке измерить нетрудно, однако сопротивление  ячейки определяется напряжением, до которого ионы реагируют на его изменение. Поведение ионов может вызвать  изменение эффективного приложенного напряжения. На рис. показаны некоторые наиболее важные явления, которые могут возникнуть в ячейке. Помимо электролитического сопротивления, может появляться емкостное сопротивление двойного слоя, или фарадеев импеданс.

Если  потенциал на электроде ниже потенциала разложения, то в слой раствора, непосредственно  примыкающий к электроду, будут  притягиваться ионы противоположного заряда и образуется заряженный слой (рис 2).

Этот  заряженный, или двойной, слой состоит  из двух частей: 1) тонкого внутреннего  слоя, в котором концентрация ионов (или потенциал) линейно падает с  расстоянием от поверхности электрода; 2) размытого слоя, в котором концентрация ионов падает экспоненциально.

Рис 2. Ячейка детектора электропроводности.

Возникновение двойного слоя снижает напряжение, приложенное к объему электролита.

Если  потенциал на электроде выше потенциала разложения, то будет происходить  электролиз. В результате процессов  окисления на аноде и восстановления на катоде через границу раздела  электрод — раствор потечет ток. Возникающий при этом фарадеев импеданс может быть вызван медленными процессами переноса электронов либо увеличением  или уменьшением количества ионов  на поверхности электродов. Фарадеев импеданс также меняет эффективное  напряжение, приложенное к электроду.